介绍一篇发表在Analytical Chemistry上的文章“A Detergent-Free Grinding Sample Preparation Method Dramatically Enhances PELSA for Mapping Integral Membrane Proteins–Ligand Interaction”，通讯作者是来自大连化物所的叶明亮教授，叶老师的主要研究方向是蛋白质组学及翻译后修饰鉴定。

PELSA（peptide-centric local stability assay, 肽段中心局部稳定性分析）技术在鉴定蛋白质-配体方面提供了有力的技术支持，但该方法与其他基于蛋白质稳定性的技术都通常使用不含洗涤剂和变性剂的缓冲液来提取蛋白质，以保持蛋白质的天然构象，这使得这类方法对整合膜蛋白（IMPs）的鉴定变得困难。因此，本文聚焦于解决传统去垢剂提取膜蛋白易破坏其天然构象、干扰配体结合分析的技术瓶颈，开发了一种无去垢剂的机械研磨样品制备方法（Detergent-Free Grinding sample preparation method, DFG），并与PELSA联用，构建新型蛋白质组学平台DFG-PELSA，用于高效、高灵敏度地鉴定整体膜蛋白与配体的相互作用及结合区域，推动基于结构的药物发现与毒性机制研究。

该技术核心流程如下：DFG样品制备时将细胞与不锈钢研磨珠置于–40 °C预冷系统，以5 m/s、30 s×2循环进行机械研磨，离心获得含膜碎片、囊泡及蛋白-脂质复合物的PBS悬液，无需去垢剂。为鉴定该方法的提升效果，文章中主要将其与传统的液氮反复冻融制样发进行比较。实验结果中，DFG法从HeLa细胞中鉴定1090种跨膜蛋白，是冻融法的2.5倍，与0.5% DDM去垢剂法相当，且磷脂含量提高2.4倍，鉴定到的蛋白显著富集于膜系统（如线粒体膜、内质网膜等），证明机械研磨可高效释放膜组分并保持天然构象。

随后，作者在膜蛋白提取优化的基础上，将研磨法与PELSA结合，构建DFG-PELSA平台，考察DFG-PELSA是否能提升对跨膜蛋白靶点的识别效率。选用ATP类似物AMP-PNP，比较研磨与冻融法在识别ATP结合蛋白方面的差异。结果中，作者新发现多个跨膜ATP结合蛋白并精确定位AMP-PNP结合区域。且值得注意的是，该方法也保留了对可溶性蛋白靶点的识别能力。

作者将该方法推广到多个应用，一是解析EGFR-TKI的on/off-target机制，二是检测跨膜区配体结合的远程效应（即DFG-PELSA是否能检测配体结合于跨膜区所引起的构象变化），证明了该技术适用于研究复杂膜蛋白的变构机制。

总的来说，DFG-PELSA突破了传统膜蛋白配体筛选的技术瓶颈，为药物靶点发现、毒性机制阐明及难成药膜蛋白功能研究提供了强有力的原生态蛋白质组学工具。

本文作者：FTY

责任编辑：MB

DOI：10.1021/acs.analchem.5c03099

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03099