生化里的双试剂详解

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记得很多年前我讲课时问大家:双试剂好还是单试剂好?,得到了异口同声的回答是:双试剂好!这之前我和很多业界前辈、技术同行交流过类似的问题,当我我和大家开玩笑的说:答案是卖什么就说什么好!!!其实我想表达的意思是各有各的好,合适就是最好。比如有些低端的生化分析仪试剂位有限,用双试剂时工作效率会下降。再比如,AU480只有一个试剂臂,双试剂虽然不影响工作效率,比如做一百个测试单试剂情况下试剂臂动100次而双试剂的情况下试剂臂要动作200次,我们在临床维修中试剂臂比样品臂出故障的机会大。


再从另外一个角度聊,如果我可以做成单试剂,分开两瓶谁不会啊?如果我单试剂的性能和双试剂一样,里面的技术含量一定比双试剂高不少呢,对吗?还有就是有些项目没有必要做成双试剂的,具体项目我就不说了。


我今天在这里是讲双试剂的,他如果和仪器很好有机的配合,可以发挥出巨大的能量。我们由浅入深一步一步把它说透。


一.双试剂终点法:我们上一期讲了双波长可以扣除黄疸溶血&乳糜血的干扰,但是,不同的双波长设定对干扰物的克服程度不同,克服黄疸就无法克服溶血,要看这个项目最怕什么干扰,而且双波长选错了以后还会出现【该死的双波长】问题。接下来说终点法双试剂,试剂一通常是缓冲液,不参与反应,这个时候如果标本有了颜色的干扰(溶血、黄疸、乳糜),在加入试剂二前做一个空白,就可以有效的消除干扰,起到了样品空白的作用。那么双试剂可以解决一切问题吗?当然不能,比如,早期的OCPC法的钙试剂,单试剂溶血标本明显偏高,双试剂就没问题,但是由于OCPC法远远不及现在的偶氮三砷法的单试剂钙稳定,这个方法基本被废除,单试剂的偶氮三砷法的钙不怕溶血的干扰,没有必要做成双试剂(因为OCPC法钙测定波长受溶血干扰,偶氮三砷法钙测定的波长和溶血没有交叉)。


像K/Mg/AST/LDH等项目,红细胞破坏以后里面含有这些成分,双试剂双波长都没有效果。


另外,双试剂终点法还有如下好处:目前临床多用的Trinder反应(多用于代谢物的测定),虽然很多公司优化了底物,但还是会受到胆红素和抗坏血酸(Vc)的干扰,很多公司在试剂一中加入抗坏血酸氧化酶,就能大大消除这种干扰。(临床中常见的尿酸偏低,血糖偏低要可虑这种因素)


下面以甘油三脂为例:


                      脂肪酶

甘油三脂--------------------甘油+游离脂肪酸

                   甘油激酶

甘油+ATP-------------------甘油-3-磷酸+ADP

                             甘油-3-磷酸氧化酶

甘油-3-磷酸+O2-------------------------------磷酸二羟丙酮+H2O2

                                     过氧化物酶

H2O2+4-AAP+ESPAS----------------------醌亚胺+H2O


在试剂一中加入:抗Vc氧化酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、 过氧化物酶,有Vc会被氧化,标本中如果有游离甘油会被消耗并作为本底,试剂二加入脂肪酶,扣除加试剂一前的空白,就得到了真正的甘油三脂的结果。(题外话:TG的试剂里面含有2000U/L的脂肪酶,所以在携带污染里面TG非常影响脂肪酶的测定)。


二.双试剂速率法测定酶,这个例子最初由单试剂转变成双试剂最多试剂销售讲给客户了,我们今天拿出来复习一下,首先看看反应方程式:


                                       ALT

L-丙氨酸+a-酮戊二酸--------------------丙酮酸+L-谷氨酸

                                     LDH

丙酮酸+NADH-----------------------------乳酸+NAD+H2O


糖尿病的病人会出现酮症酸中毒,丙酮酸会升高,如果是单试剂这样会间接的影响ALT的测定。设计成双试剂后试剂一里面不含a-酮戊二酸,标本和试剂一混合以后会消耗掉外源性丙酮酸,加入试剂二(a-酮戊二酸),丙酮酸的影响被大大降低了。(大家看到了吗?这个试剂里面含有LDH,大约2000U/L,为什么不会出现ALT影响LDH的问题呢?答案是LDH的正常值范围很大,影响一点看不出来)。


三.双试剂速率法测定底物,以没法尿素(Urea)为例,介绍双试剂抗干扰的情况:

                       脲素酶

尿素+H2O---------------------2NH4+CO2

                                                 GLDH

NH4+α酮戊二酸+NADH-----------------------谷氨酸+NAD+CO2


1)如果标本中有内源性的NH4(比如肝昏迷),会引起测定结果偏高;

2)外源性的NH4,比如水机出现故障,也会造成结果偏高;

3)内源性的酶(比如血液中的LDH),在标本丙酮酸比较高的情况下,会与GLDH竞争氧化NADH从而造成测定结果的阳性偏差;如果设计成双试剂,标本和R1(α酮戊二酸,NADH,GLDH),先去除NH4及酶(LDH、丙酮酸)的干扰,再加入试剂2(脲素酶)启动真正的反应。


四.以苦味酸法的肌酐解释双速率法:酶法肌酐的出现使苦味酸法的肌酐处于淘汰的边缘,我们今天是以这个例子讲清楚原理。


                            碱性环境

苦味酸+肌酐----------------------红橙色化合物


临床上为了减少假肌酐的干扰,利用假性肌酐反应比较慢这一特点,采用初始速率法。但此方法易受胆红素(某些标本或高值质控的胆红素含量较高)的干扰,因为碱性环境(氢氧化钠)能氧化胆红素成胆绿素(此反应比较慢,不能瞬间完成),在肌酐的测定波长520nm可以看到吸光度的下降,用双速率法(Double Rate Assay)可以克服这个干扰。

五.以CK-MB为例继续解释双速率法:CK-MB目前存在的问题是复合质控中没有这个项目需要单独订购,第二,非常受到标本存放时间(不是CK-MB不稳定,是因为时间长了干扰增加)和溶血的干扰(尤其是儿童,当小孩怀疑心肌炎测定CK-MB的结果通常是高的),以致于CK-MB这个项目被免疫方法代替的境地,实际上如果使用双速率法,就能排除干扰,这个我们在临床上积累大量的经验。

                              CK

磷酸肌酸+ADP----------------肌酸+ATP

                              HK

ATP+葡萄糖-----------------------葡萄糖-6-磷酸+ADP

                                  葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

葡萄糖-6-磷酸+NADP--------------------------------6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H


这个是CK-MB的反应方程式,腺苷酸激酶(ADK)会影响这个反应,ADK存在于肝、肾、红细胞、血小板中,RBC中并没有CK-MB,但是却含有ADK,所以溶血会有正干扰,大家试一试,如果没有分离胶的试管,在冰箱里面过夜(因为红细胞膜的通透性改变,ADK释放到血清中),再次复查CK-MB偏高的概率会非常大。


我们分析一下ADK的干扰反应:


                     ADK

2ADP-------------------------ATP+AMP


大家结合上面的反应方程式分析,如果标本中存在少量ADK,ADP是第一步反应的底物,在没有CK和磷酸肌酸的作用下,ADP就能转化出ATP,从而向下进一步发生反应。


一般的试剂厂家会在试剂中加入ADK的抑制剂AP5A(五磷酸二腺苷)来抑制ADK的干扰,但是抑制率只有95-97%,AP5A加多了会抑制CK的反应。也就是说还有3-5%的没有被抑制,对于正常的标本会升高0-6U/L,极端的标本会影响非常高,应用双试剂速率法,试剂一中什么都含有(包括激活剂镁离子)唯独不含有磷酸肌酸,加入标本后产生的吸光度变化就是干扰反应,加入试剂二后是两个反应的合反应,双速率法可以有效消除这种干扰。下面是示意图:


下面这个图是很多年前我记录的。



大家看看吸光度在十点以前是逐渐上升的。


0.1127--0.1137--0.1146--0.1155--0.1165逐渐上升。


总结:现在市面上的CK-MB多为液体双试剂,因为Mg离子的加入会影响试剂的稳定性,目前在售的液体双试剂均没有此功能。


来源:打开维修之门


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