‍‍‍细胞表面寡糖在细胞的各种生理和病理过程中都发挥着重要的作用。然而由于寡糖结构的复杂性，对寡糖的检测分析十分困难。传统用于寡糖的研究分析手段普遍存在灵敏度低、特异性差的特点。近年来，化学酶法标记技术的发展为研究细胞表面寡糖提供了一个高效而灵敏的研究工具 (Figure 1)。化学酶法标记技术利用糖基转移酶催化的体外反应将含有生物正交反应基团的非天然糖分子修饰到目标寡糖决定簇（末端单糖、二糖或者三糖）上。然后通过生物正交反应引进报告探针比如荧光分子从而可以实现对目标寡糖进行定性定量分析。糖基转移酶严格的受体特异性使得化学酶法标记的特异性极高。因而有着广泛的应用前景。比如，利用Bovine GalT检测O-GlcNAc的试剂盒已经商业化。然而由于缺少含有生物正交反应基团的非天然糖核苷酸，化学酶法标记技术的应用受到了很大的限制。为了解决这个问题，佐治亚州立大学王鹏教授和文留青博士领导的研究课题组报道了利用化学合成与酶法合成相结合的技术平台合成了大量含有生物正交基团的非天然糖核苷酸。

Figure 1. Chemoenzymatic labeling strategy for probing cell surface glycans. 

目前常用于化学酶法标记技术平台的有三大类糖基转移酶：GlcNAc、GalNAc和Neu5Ac糖基转移酶，分别利用UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc和CMP-Neu5Ac作为底物供体。然而因为缺少活性较好的酶，UDP-GacNAc和UDP-GalNAc的糖核苷酸类似物合成比CMP-Neu5Ac类似物的合成困难不少。目前只有少数含有叠氮基团的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc类似物的合成报道。为此，研究者设计了25种非天然UDP-GlcNAc （4 to 15）和UDP-GalNAc (19 to 31)糖核苷酸类似物作为合成目标 （Figure 2）。这些类似物包含了大部分之前用于糖分析的生物正交基团。

Figure 2. Structures of the designed UDP-GlcNAc and UDP-GalNAc derivatives.

研究者首先合成了单糖类似物然后尝试着用传统的酶转化法合成UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc 类似物。酶转化法需要两步反应 （Scheme 1 和Scheme 4），第一步由激酶催化生成C1位磷酸化的磷酸单糖（α 构型），第二步，UDP焦磷酸化酶利用UTP作为供体加上UMP生成UDP-sugar，并释放一个焦磷酸。研究者发现所有的单糖类似物都可以被第一步的激酶（NahK from Bifidobacterium）有效的识别并生成磷酸单糖，但是第二步的UDP焦磷酸化酶只能识别个别磷酸糖。尽管作者测试了很多种类的UDP焦磷酸化酶，然而只有一部分可以可以通过酶法转化得到（4 to 13; 19, 20, 和21）。为了得到类似物10、11、26和27，研究者设计了Scheme 2 和Scheme 5。先将GlcNH2和GalNH2的氨基用TFA保护基保护。利用酶转化法生成UDP-GlcNTFA和UDP-GalNTFA，然后用氢氧化钠水解掉TFA得到纯的UDP-GlcH2和UDP-GalNH2。最后通过选择性修饰的NH2基团得到10、11、26和27。类似物14、15、30和31是利用原料2、3、17和18，以及Cu+催化的Click反应将含有生物素的基团加上加到原料的C2或者C6的叠氮基团（Scheme 3 和Scheme 6）。这种类型的底物含有报告基团生物素，可以十分灵敏的被链霉素检测，因而有着较高的报告效率。此外为了克服第二步UDP焦磷酸化酶不能识别第一步的磷酸化的单糖的困难，研究者设计了化学耦合UMP的策略（Scheme 7）。利用商业化的UMP morpholodate作为活化的UMP供体，与磷酸化的单糖进行耦合，可得到类似物20、22、23、24、25和29。

Scheme 1. Chemoenzymatic synthesis of UDP-GlcNAc derivatives 4 to 13

Scheme 2. Chemoenzymatic synthesis of 10 and 11

Scheme 3. Chemoenzymatic synthesis of 14 and 15

Scheme 4. Chemoenzymatic synthesis of UDP-GalNAc derivatives 19, 21, and 28

Scheme 5. Chemoenzymatic synthesis of 26 and 27

Scheme 6. Chemoenzymatic synthesis of 30 and 31

Scheme 7. Chemoenzymatic synthesis of UDP-GalNAc derivatives 20, 22, 23, 24, 25 and 29

Figure 3. Donor specificity study of B3GNT6, GCNT1, BgtA, GTA, CgtA and Bovine GalT with standard oligosaccharides or monosaccharide.

之后，研究者又利用合成的非天然糖核苷酸筛选了用于化学酶法标记技术的六种糖基转移酶（B3GNT6、GCNT1、CgtA、BgtA、GTA和GalT）。之前报道中，这些糖基转移酶主要利用UDP-GlcNAz和UDP-GalNAz用来标记目标结构 （Figure 3）。研究者发现除了UDP-GlcNAz和UDP-GalNAz外，很多其他的非天然的糖核苷酸类似物也可以被这些酶识别，有些甚至有着更高的活性。这些结果为以后的化学酶法标记技术的多样化标记应用奠定了基础。

相关工作发表在ACS Catalysis，文章的第一作者是佐治亚州立大学文留青博士，通讯作者是王鹏教授和文留青博士。

该论文作者为：Liuqing Wen*, Madhusudhan Reddy Gadi, Yuan Zheng, Christopher Gibbons, Shukkoor Muhammed Kondengaden, Jiabin Zhang, and Peng George Wang*