介绍一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，标题是“Glyco-Engineering Cell Surfaces by Exo-Enzymatic Installation of GlcNAz and LacNAz Motifs”，通讯作者是加拿大女王大学的Chantelle J. Capicciotti教授。在本文中，作者提出了一种新的外源酶糖工程策略，实现在细胞表面安装GlcNAz或LacNAz。

图1 在细胞表面安装2型LacNAc基序的一般外酶糖工程策略

鉴于LacNAc结构的重要生物学功能，作者尝试扩展外源酶工程策略，以设计带有生物正交化学报告基因的2型LacNAc基序的细胞表面聚糖。本文报道了化学酶法合成了一小部分非天然的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc衍生物，以及人类LacNAc合成酶B3GNT2和B4GalT1对供体和受体GlcNAc衍生物的耐受性。利用GlcNAcT B3GNT2对天然和非天然GlcNAc衍生物进行外酶编辑细胞表面聚糖。GlcNAz修饰的工程细胞也进一步扩展验证了B4GalT1和UDP-Gal，证明了编辑细胞聚糖以展示修饰的2型LacNAc表位的概念验证应用(图1)。

图2 NahK结合PmGlmU与AGX1用于UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc类似物合成

根据已报道的一锅多酶（OPME）体系，作者进一步进行了条件优化，在NahK，AGX1，PmGlmU，PmPPA体系中系统优化了浓度，配比，反应时间等条件，对一系列UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc衍生物进行了合成效率验证，包括azide，alkynyl，diazirine修饰（图2）。

图3 B3GNT2与B4GalT底物特异性探究

在得到一系列UDP糖衍生物后，作者以LacNAcβ-MU为底物，首先在体外验证了这些衍生物能否被B3GNT2催化，并用HPLC-MS进行反应监测（图3）。其中，天然底物UDP-GlcNAc在6h内有85%转移得到三糖。UDP-GlcNAz，UDP-GlcNAl和UDP-GlcNDAz在2h时转化率分别为9%，24%和5%，24h时转化率分别为35%，50%和16%。通过从1 eq提高5 eq，UDP-GlcNDAz的转化效率提高到18%。而相对来说，B4GalT1对UDP-GalNAc衍生物的催化活性则相对高很多。

图4 使用B3GNT2和UDP-GlcNAz进行细胞表面聚糖重构

为了进一步探究B3GNT2和B4GalT1应用于外源酶糖工程的可行性，作者分别在Jurkat和U937悬浮细胞系以及HS-578-T和HEK293T贴壁细胞系中进行了验证（图4）。在经过NanH水解细胞表面唾液酸处理后，加入B3GNT2+0.2 mM UDP-GlcNAz 孵育2h，并进一步使用SPAAC反应偶联DBCO-405，使用FACS作为信号读出。此外，作者还使用了western blot+SPAAC偶联DBCO-biotin的方式验证了HS-578-T细胞系体系并获得了较强的信号响应，这与与流式结果一致。而在使用PNGase F进行N糖酶切处理后的B3GNT2标记结果显示信号几乎不可见，作者认为这是由于B3GNT2只能针对N-糖进行标记，而此前文献报道B3GNT2标记范围包括N-糖，O-糖和糖脂。作者认为这是由于HS-578-T细胞系无法提供合适的B3GNT2转糖位点导致。同样的实验现象在HEK293T细胞系也得到了重复，这与此前糖组学分析中报道的HEK293T细胞系具有较低丰度的延伸核心2型O-聚糖结果一致。因此，即使糖脂上具有LacNAc位点，由于延长距离不足的限制也会导致B3GNT2无法有效标记。基于以上的实验结果，作者认为在进行外源酶糖工程时应该慎重选择细胞系。

图5 重构细胞表面LacNAz和LacNAc表位

总的来说，作者使用B3GNT2和B4GalT1开发了一种新的外源酶细胞表面糖工程策略，为研究细胞表面LacNAc生物学功能提供了新的工具。