分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为“Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer”，通讯作者是来自Scripps研究所的John Yates教授和Kendall Nettles教授，研究方向分别是开发新型蛋白质组学工具和通过基于结构的方法开发新药辅助癌症治疗。

基于Bottom-up的蛋白质组学技术通过分析蛋白质酶解产生的肽段以对蛋白质进行表征，近年来得到广泛的应用。但这种方法因其无法保留不同蛋白质或辅因子之间的非共价相互作用，在研究蛋白质复合物上面临挑战。考虑到上述问题，本文发展了基于非变性质谱的top-down蛋白质组学策略nTDP，能够在单次实验中提供有关最大到70 kDa的蛋白质复合体的详细信息。该技术被应用于从细胞提取物中解析EGFR过表达的耐药性乳腺癌中耐药的独特的分子机制。

在方法建立过程中，作者首先使用离线的非变性尺寸排阻色谱nSEC对蛋白组样品进行分级，来降低样品复杂性并增强低丰度蛋白在质谱仪中的检测。将分级得到的样品通过纳升液相进样，并以ESI为离子源进行软电离，在进入MS之前通过FAIMS对蛋白质离子进行进一步分离，这使得能够对质荷比相同但电荷态不同的络合离子进行分离，随后的质谱检测中采用多级质谱串联的方式用于鉴定蛋白质复合物形式及其单体形式，即在非变性条件下进行MS1分析，然后从完整的组装体中分出组分亚基进行MS2分析，最后是对每个亚基进行片段化以在MS3中实现蛋白质修饰形式的鉴定。完成检测后，使用ProSight Native软件进行数据处理。

基于此ESI-FAIMS-MSn的workflow，作者选定了在乳腺癌细胞中高度表达的MIF蛋白进行验证，这是一个异源三聚体蛋白，首先MS1中的谱图允许±1 Da的质量偏差，能够可靠地鉴定到诸多蛋白质组装体，在其中发现该三聚体蛋白具有典型的多电荷特征，并且详细分析MS1谱图后，发现该三聚体有多种组合类型，小亚基可能产生截短或带有修饰的形式。经过HCD碰撞解离后，由四极杆质量分析器进行分离，能够观察到单体蛋白的多样性，并进一步在HCD池中碎裂，进入MS3分析，能够特征性地识别到不同氨基酸位点上的亚硝基化修饰和乙酰化修饰等。

接下来，对野生和耐药型乳腺癌细胞中的NUTF2蛋白质组装体进行表征，发现了EGFR诱导了NUTF2的大量二聚体解离，并且发现在耐药性细胞中产生独特的三乙酰化的蛋白复合体。通过MS2中对单体蛋白解析，也鉴定出几种新型的单体蛋白修饰形式。这揭示了EGFR过表达的乳腺癌细胞中耐药性的产生可能与NUTF2的复合体形式不同有关。

仔细解析NUTF2蛋白上的几个酰化修饰位点，发现其中K4位点靠近核孔蛋白结合位点，K55和K63靠近与核质运输相关的Ran蛋白的结合位点，它们都与调节细胞的基本生理功能相关。通过细胞实验发现几个位点的突变将会显著影响细胞增殖的能力，从而导致细胞产生耐药性的表型。

总的来说，本文发展了一种非变性的top-down蛋白质组学技术，能够用于从复杂的蛋白质组学样品中对不同的蛋白质复合体的非共价相互作用以及单体蛋白类型和其上的翻译后修饰类型进行解析。

本文作者：SHL

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41589-025-01866-8

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-01866-8