分享一篇发表在Angew上的文章。文章的题目是“含有疏水脯氨酸衍生物的点击环化细胞穿透肽，实现高效的细胞内递送”。文章的通讯作者是来哥本哈根大学化学系进化化学生物学中心的Morten Meldal教授。该团队主要研究领域包括计算化学、化学生物学、有机化学、组合化学、蛋白质化学等。

近年来，生物制药研发的重心正从小分子药物转向抗体、RNA与环肽等大分子药物，为靶向以往“不可成药”的细胞内靶点开辟了新前景。然而，这类生物制剂普遍存在膜透性低的瓶颈，其较大的体积、高极性及代谢不稳定性严重限制了其细胞内递送，成为靶向胞内蛋白-蛋白相互作用（PPI）的主要障碍。

为克服此障碍，已有多种策略被开发，包括利用纳米颗粒包裹、与细胞穿透肽（CPPs）偶联、结构重构及受体介导内吞等。其中，环状CPPs（cCPPs）因较线性肽具有更优的膜透性而备受关注。现有研究多聚焦于序列设计、疏水修饰及电荷调控，并发现疏水残基（如十二烷基）和特定结构（如富含精氨酸的cR10）可显著影响穿膜效率。

脯氨酸及其衍生物因可诱导β转折，成为提升cCPPs穿透性的重要结构单元。然而，基于反式-4-氨基/羟基-L-脯氨酸衍生的二级胺与醚类结构对穿透行为的影响仍缺乏系统研究。

为此，本研究设计了四种新型非天然氨基酸（P1-P4），并将其用于构建16种线性和环状CPP。并通过分子动力学模拟分析精氨酸残基的空间分布（电荷集中或分散）以及环化结构对肽的性质的影响。

研究发现：环状肽通常比线性肽具有更好的穿透效率。在连接键类型上，来源于反式-4-羟基-L-脯氨酸的仲胺连接（P3, P4）比醚连接（P1, P2）更能促进穿透。在疏水基团方面，萘-2-亚甲基基团（芳香族）比十二烷基链（脂肪族）更有利于提高通透性。在精氨酸分布方面，在环状支架中，将两个精氨酸置于环外并间隔开，比所有精氨酸都位于环内更能增强细胞穿透能力。

综合了上述优势结构（环状、仲胺连接、萘基、优化的精氨酸分布）的cCPP 15，表现出最高的细胞穿透效率，甚至比经典的TAT肽高出约40%。分子动力学模拟显示，cCPP 15能通过其疏水萘基嵌入细胞膜，并通过精氨酸与膜磷脂头基相互作用。其内化机制主要是动力蛋白促进的内吞作用，且该过程具有温度和时间依赖性。cCPP 15在多种细胞系中均表现出良好的穿透能力，适用性广。

研究进一步将cCPP 15的类似物（cCPP 18）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共价连接。实验证明，只有共价连接的EGFP-cCPP 18复合物能被有效递送入细胞，而单独的EGFP或两者的简单混合物则无法进入，凸显了cCPP 15支架在递送大分子货物方面的卓越能力。

本研究确立了设计高效环状细胞穿透肽（cCPP）的关键原则：将反式-4-羟基-L-脯氨酸衍生物整合至cCPP 15支架可赋予优异穿透性；其中，仲胺连接（尤其结合萘基）相较于醚连接能显著增强穿透效果，而精氨酸残基围绕转-4-氨基-L-脯氨酸核心的合理分布可进一步提升膜通透性，但额外的疏水性修饰并未增加通透性。这些发现为未来理性设计高效CPP提供了指导。

本文作者：THT

责任编辑：LYC

DOI：10.1002/anie.202504862

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202504862