分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题为：Genetic Code Expansion in Probiotics Enables the Secretion of Covalent Protein Drugs in Mice。该文章的通讯作者为来自中国医学科学院北京协和医学院的罗惠鑫助理教授和来自兰州大学的王锐教授。

    单克隆抗体、纳米抗体等蛋白药物因高靶向性与强效性已成为重要治疗手段，引入非天然氨基酸可进一步拓展其功能。但蛋白药物的临床应用却受限于递送难题：口服途径虽便捷，却容易被胃肠道酸性环境与酶解作用破坏，且局部递送效率低下。而大肠埃希菌Nissle1917（EcN）等益生菌具有肠道定植能力，可抵抗胃肠道降解并持续释放药物，但其功能受限于天然氨基酸库的单一性，基因编码扩展技术可通过非天然氨基酸（UAA）的引入克服这一限制。

    在本文中，作者开发了一种基于基因编码扩展技术的益生菌平台，成功实现了通过肠道局部递送共价蛋白药物。该平台利用工程化的EcN菌株，结合非天然氨基酸（FSY）插入系统，成功合成并分泌了具有共价结合功能的抗IL-23纳米抗体。如图1所示。

图1. 定点生物合成抗IL-23共价纳米抗体的工程化益生菌

    作者首先设计了分泌纳米抗体的工程化EcN平台，共包括三个部分：表达抗IL-23纳米抗体的质粒（EP）、编码正交的氨酰基-tRNA合成酶和tRNA对的非天然氨基酸插入质粒（ISP）、基于α-溶血素的I型分泌系统（T1SS）。通过构建pTrc99a-IL23Hly质粒，将纳米抗体与C端HlyA分泌信号融合，IPTG诱导后，纳米抗体可被高效分泌至上清液。为了将氟硫酸酪氨酸（FSY）引入纳米抗体当中，作者又将硫酸酪氨酸特异性合成酶（STyrRS）的162号位突变为赖氨酸，使其酶能够识别 FSY，并把它插入到纳米抗体的特定位置。随着FSY浓度的增加，EcN中纳米抗体的表达水平呈剂量依赖性增加。插入后，纳米抗体会具有共价结合的能力，效果大大增强。如图2所示。

图2. 建立分泌共价纳米抗体的工程化EcN平台

    接下来，作者通过构建生物发光报告系统来验证工程化EcN菌株在肠道内实现FSY介导的原位蛋白质生产。利用luxCDABE操纵子，在luxA基因中引入琥珀密码子突变，只有带有特定琥珀突变的EcN菌株在FSY存在时表现出强烈的发光信号，证明了FSY的成功插入。接下来，作者通过口服给药将工程化EcN菌株和FSY给予小鼠，结果显示FSY能够驱动肠道内特定位置的蛋白质表达，且发光信号仅出现在口服FSY的小鼠肠道中。如图3所示。

图3. FSY介导工程化EcN在小鼠肠道内实现原位蛋白质生产

    在建立了工程化EcN平台后，作者希望开发一种高效的共价抗IL-23纳米抗体作为治疗药物。由于缺乏抗IL-23纳米抗体与IL-23 p19亚基的结构复合物，作者将突变重点放在互补决定区3（CDR3），生成了13个不同位点的纳米抗体突变体，并在这些位点引入琥珀密码子，发现位于98、101、102、105和106位的变体与IL-23 p19亚基形成了共价复合物，其中R98FSY突变体显示出显著更强的结合活性（IC50 = 5.9 pM），且与IL-23的共价反应不可逆。如图4所示。

图4. 抗IL-23共价纳米抗体的设计与表征

    最后，作者通过工程化EcN平台分泌共价抗IL-23纳米抗体R98FSY，治疗炎症性肠病（IBD）。通过饮用含2%右旋糖酐硫酸钠（DSS）的水诱导肠道炎症，发现接受EcN-IL23Nb-98M和FSY治疗的小鼠在急性阶段体重有回升，结肠长度得到了显著保持，肠道炎症明显减轻，疾病活动指数（DAI）和脾脏指数显著低于对照组，炎症因子IL-6和TNF-α的水平大幅下降，证明了FSY激活的EcN-IL23Nb-98M显著缓解了结肠炎症状，具有IBD靶向治疗的潜力。如图5所示。

图5. 分泌共价纳米抗体的工程化EcN缓解小鼠炎症性肠病

    综上所述，本文介绍了一种结合基因编码扩展技术的工程化益生菌平台，能够在肠道内局部生产和分泌共价抗IL-23纳米抗体。通过插入非天然氨基酸FSY，纳米抗体能力显著增强，成功缓解了小鼠炎症性肠病，为口服递送具有特殊功能的蛋白药物提供了新途径，具有重要的临床转化潜力。

作者：YXM 

DOI: 10.1021/jacs.5c17978