Closthioamide（CTA）是一种罕见的含有硫代酰胺的非核糖体肽，CTA的肽骨架组装过程至今未知。通过使用体外生化分析，证明CTA的酰胺骨架是以一种不寻常的硫代模板化途径组装的，并且由ATP-grasp蛋白和半胱氨酸蛋白酶蛋白家族的新成员催化而成。使用ATP-grasp蛋白作为生物信息分析靶标，在不同的细菌门中鉴定了数百个不依赖于非核糖体肽合成酶（NRPS）的硫代模板化生物合成基因簇。本文不仅阐明了CTA的生物合成途径，而且为发现非典型生物合成途径产生的其他次级代谢产物提供了基础。
叨叨1：非核糖体肽（NRPs）是一类结构迥异、具有多种生物学活性的次级代谢产物，绝大多数NRP有共同的生物合成来源。通常，这类化合物由多模块、硫代模板化的非核糖体肽合成酶（NRPS）合成。然而，研究发现NRPs也可以通过不依赖NRPS的途径组装合成。一般认为硫代模板化途径是NRPS依赖的，而那些使用独立肽连接酶的途径是非硫模板化的。然而，最近也发现存在一种硫代模板化但不依赖NRPS的合成途径，用于CTA的生物合成。
叨叨2：ATP-grasp蛋白为一个由21种蛋白质组成的超家族，该超家族含有一个非典型的ATP结合位点，称为ATP-grasp折叠。ATP-grasp折叠由两个α+β结构域组成，这两个结构域在它们之间“抓住”一个ATP分子。该家族的成员通常有一个整体结构设计，包含三个共同的保守焦点结构域。该家族的创始成员包括生物素羧化酶、D-ala-D-ala连接酶和谷胱甘肽合成酶，它们都通过形成酰基磷酸中间体来催化羧酸与亲核试剂的ATP辅助反应[1]。
叨叨：本号进行模式改版，将往期推荐置于文章底部，往期推荐是小编对一些和本文有关联的往期内容回顾，有兴趣的朋友可以点击。
研究者首先探究了CTA的酰胺骨架合成途径。基于CTA硫酰胺合成酶的敲除研究和重组，确定该途径是硫模板化的，硫的插入发生在与CtaE（一种肽载体蛋白，PCP）相连的对羟基苯甲酸（PHBA，p-hydroxybenzoic acid）-β-丙氨酸（βAla）聚合物上。然而，这种PHBA-βAla偶联的来源至今成谜。CTA生物合成基因簇还编码第二个PCP：CtaH，它在CTA组装中的作用尚未得到证实（Fig.1B）。研究者选择CtaH作为研究CTA骨架形成的切入点。CTA生物合成基因簇中编码的蛋白质包括ATP-grasp蛋白（CtaD）和乙酰辅酶A合成酶样（CtaI）蛋白家族的成员，这两个蛋白家族的特征成员都催化依赖ATP的羧酸与不同亲核试剂的偶联。对这两个蛋白进行了holo-CtaH的负载活性检测，结果表明CtaI是针对holo-CtaH和PHBA作用的，且依赖于ATP。
Fig.1. CTA isbiosynthesized by an NRPS-independent thiotemplated pathway.
为了验证CtaD的功能，对编码CtaD和CtaE同源蛋白的特征性生物合成基因簇进行了生物信息学分析，发现布替罗星生物合成途径中有CtaF的同源蛋白。在布替罗星合成过程中，ATP-grasp蛋白可将L-Glu加载到PCP上，受此启发，研究者用L- Asp代替βAla进行CtaD和CtaE负载试验，结果表明Asp的转移是通过磷酸化中间体进行的，而CtaD可依赖于ATP催化产生Asp-S-CtaE（Fig. 2A-D）。用CtaF重复holo-CtaE负载试验，证明CtaF可催化L-Asp转化为βAla，且只有当CtaF和CtaD共同作用时，才能使βAla聚合到holo-CtaE上依次迭代作用形成 3βAla-S-CtaE（Fig. 2E）。这些数据表明CTA的β-丙氨酸骨架的形成是硫代模板化的，并由ATP-grasp蛋白和脱羧酶协同作用。
Fig. 2. CtaD and CtaF work together to polymerize β-alanine onto holo-CtaE.
通过生物信息学分析，CtaG属于C39蛋白酶和BtrH蛋白家族，两个蛋白家族均有木瓜蛋白酶样蛋白酶折叠结构和一个保守的活性位点（Cys-His-Asp / Asn催化三联体），属于CA蛋白酶超家族。为规避溶解问题，将CtaG与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合。CtaD、CtaF、CtaI、holo-CtaE/CtaH分别与MBP-CtaG反应，在含有MBP-CtaG的反应中形成了新的峰，质量与PHBA-3βAla-S-CtaE偶合物一致（Fig. 3A）。CtaG的活性依赖于PHBA-S-CtaH的存在，PHBA-S-CtaH是CtaG转酰化反应中PHBA部分的来源。研究者前期研究发现，硫酰胺合成酶CtaC可以接受PHBA-3βAla-S-CtaE和PHBA-2βAla-S-CtaE作为底物，其底物专一性不强[2]。而由于CtaG可催化PHBA向CtaE连接的βAla链转移，其可确保仅将携带正确数量的βAla单位的底物呈现给CtaC（Fig. 3C-D）。CtaG中存在一个假定的催化三联体（C11-H128-D144），实验表明，CtaG的三个突变体（CtaGC11A、CtaGH128A和CtaGD144A）都没有活性（Fig.3A-B）。这些数据证实了CtaG在CTA生物合成中利用木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的三联体催化硫代模板转酰化反应。
Fig. 3. CtaG is a novel transacylase.
根据本文提供的数据，研究者提出了以下CTA生物合成前期步骤的更新模型（Scheme 1.）。CTA合成的这些前期步骤通过两条平行作用的PCP加载途径进行：1. PHBA由CtaA催化胆酸生成，然后由CtaI通过ATP依赖的反应加载到holo-CtaH上；2. CtaD和CtaF催化L-Asp的添加和脱羧得到βAla-S-CtaE，并经过两轮这样的反应形成3βAla-S-CtaE。两条CTA的生物合成途径汇聚在一起，CtaG催化PHBA从CtaH转移到3βAla-S-CtaE，生成的产物PHBA-3βAla-S-CtaE被CtaC反复硫酰胺化，得到硫酰胺化-3βAla-S-CtaE。研究者基于先前的基因敲除研究和生物合成中间体的检测，预测了硫胺化PHBA-3βAla二聚作用和二氨基丙烷（DAP）插入的两种可能途径。由L-Asp通过还原酶（CtaK）、转氨酶（CtaB）和脱羧酶（CtaF）的顺序作用来生物合成DAP。转谷氨酰胺酶CtaJ将两个分子的硫酰胺化-PHBA-3βAla-S-CtaE转化为CTA。然而，CtaF不能脱羧自由底物，需要使用另一种未知的代谢物作为DAP的来源，CtaJ会将两分子含DAP的产物偶联起来形成CTA。
Scheme1. Updated CTA biosynthetic pathway. Two potential pathways (A and B) for DAP biosynthesis andincorporation are displayed.
CTA酰胺骨架合成途径的阐明为挖掘其他非典型硫代模板（NCT）生物合成途径的基因组提供了难得的机会。为了寻找候选的NCT基因簇，使用BLAST在GenBank中鉴定了660个CtaD同源蛋白，并利用EFI-EST建立了序列相似性网络（Fig. 4A）。研究者分析了网络中每个CtaD同源蛋白的基因组邻域，以确定是否存在编码CtaF和CtaG同源物的基因，以及编码PCPs的基因。发现超过20%的假定硫模板化生物合成基因簇同时编码CtaF同源蛋白和CtaG同源蛋白。虽然在一个假定的生物合成基因簇中共同出现ATP-grasp 蛋白和PCP并不一定意味着产物将是NRP，但已确定的~400个未鉴定的基因簇可作为发现其他的NCT生物合成途径及其相应产物的起点。
Fig. 4. Genome mining for additional noncanonical thiotemplate pathways.
1.鉴定了四种CTA生物合成酶，它们负责CTA酰胺骨架的硫模板化组装；2. CTA的酰胺骨架是以一种不依赖于非核糖体肽合成酶的硫代模板化生物合成途径组装的，并且由ATP-grasp蛋白和半胱氨酸蛋白酶蛋白家族的新成员催化；3. 建立非典型硫代模板生物合成基因簇的生物信息学分析方法。
来源：遇见生物编辑部
目前评论：0