AHL合酶的酰基特异性参与玫瑰杆菌属细菌的群体感应

N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）是重要的细菌信使，通过群体感应以细胞密度依赖性方式介导不同的细菌性状。AHL也由海洋玫瑰杆菌属的许多细菌产生，其构成海洋微生物组内的大群。通常，细菌产生链长和氧化状态不同的AHL的特定混合物，但生物合成酶LuxI同源物如何选择正确的酰基前体在很大程度上是未知的。我们分析了Dinoroseobacter shibae和三种Phaeobacter抑制剂的AHL产量菌株，揭示菌株特异性混合物。虽然物种之间存在很大差异，但脂肪酸谱，AHL生物合成的酰基前体库非常相似。为了测试酰基链选择性，来自D. shibae DFL-12 的三种酶LuxI 1和LuxI 2以及来自P. inhibitor的 PgaI 2 抑制 DSM 17395在大肠杆菌中异源表达并且分离的酶用于体外孵育实验。 。酶很容易接受缩短的酰基辅酶A类似物，脂肪酸的N-泛酰基半胱胺硫酯（PCE）。合成了15种PCE，链长从C 4到C 不等20，不饱和度并且还包括不寻常的酸的酯，例如，2 ë，11 ž -C18：2-PCE。担任主要AHL的前体，后者D. shibae DFL-12的LuxI 1，2 ë，11 ž -C18：2-高丝氨酸内酯（HSL）。孵育实验显示PgaI 2接受除C 4和C 20 -PCE 之外的所有底物。竞争实验证明该酶优选C 10和C 12 PCE。与此相反，鲁西酶D. shibae是更有选择性。而2 E，11 Z.-C18：2-PCE优先被LuxI 1接受，除了较短的饱和C 10 -C 14 -PCE 之外，所有其他PCE 均不被接受。AHL合酶LuxI 2仅接受C 14 PCE和3-羟基癸酰基-PPE 。总之，AHL中的链长选择性可以在不同的AHL酶之间变化。在研究的酶中都发生了广泛的底物接受和调节的特异性。

关键词： 酸枣（Dinoroseobacter shibae） ; 脂肪酸组成; N-酰基高丝氨酸内酯; 群体感应; Phaeobacter抑制

Roseobacter组，所述的子组Rhodobacteraceae家族，构成一类重要的革兰氏阴性的海洋细菌的，在许多不同的栖息地存在的[1,2] ，在淡水中以及在表面上的[3] 。它们可以产生多种次级代谢产物，包括抗生素[4,5]，挥发性化合物[6,7]，低聚羟基丁酸[8]和一系列N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）[8-10]。AHL是群体感应信号传导化合物，用于细胞 - 细胞通讯，以调节由细胞密度调节的几种生理特征，即'法定人数' [11-16]在roseobacters，例如，在生产中的抗生素tropodithietic酸的Phaeobacter inhibens [15]和在细胞分化Dinoroseobacter shibae [14] 。Roseobacter group AHLs的特征是饱和的，不饱和的，有时是氧化的酰基链，长度在C 8和C 18之间 [8]，除了Rugeria pomeroyi DSS-3 产生的芳香族对 -胡萝卜素高丝氨酸内酯[17]。

在最近的一项分析中，我们显示了从大型藻类表面分离的24种Roseobacter组细菌菌株中的19种存在AHL [8]。最普遍的AHL是7-十四烯酰高丝氨酸内酯（7-C14：1-HSL），存在于7种菌株中。观察到系统发育和AHL发生之间没有明确的相关性。在一些菌株中，仅检测到一个AHL，而其他如P. gallaeciensis BS107产生了八个不同的AHL [8]。

AHL的生物合成由LuxI酶或其同源物介导，并且通常伴有调节蛋白LuxR [18,19]。将ACP结合的脂肪酸酰基1转移到S-腺苷甲硫氨酸（SAM，2）的氨基上，然后取代硫酯基团的良好离去基团5'-脱氧-5'-硫代甲基腺苷（5）。 ，导致高丝氨酸内酯4的形成（方案1）。最近，LuxI-同系物，BjaI [20]更喜欢酰基辅酶A（CoA）底物而不是常见的ACP前体[21]。

LuxI型酶是最广泛和最了解的AHL合酶。已发表四种LuxI型酶结构，涵盖ACP和CoA依赖性结构，其具有不同的链长和在C-3处的酰基链的不同氧化态[21-24]。观察到AHL合酶的多样性。对未取代的3-氧代或3-羟基酰基前体的偏好是通过AHL合酶活性位点内的结合相互作用介导的[18,21]。对AHL合酶的链长选择性的研究是有限的。BjaI可以接受从异戊酰基-CoA，天然底物到异壬酰基-CoA的底物[21]。

LuxI 1，LuxI 2和LuxI 3三种不同的LuxI同源物出现在Dioroseobacter shibae DFL-12中[14]。最近，我们惊讶地发现由来自D. shibae DFL-12 的LuxI同源物合成的AHL的结构取决于表达酶的宿主[10]。LuxI 1在大肠杆菌中的表达导致9：C18：1-高丝氨酸内酯（HSL），C16：0-HSL和C14：0-HSL的2：1：0.3混合物的主要形成，而过表达其亲本菌株提供天然产物2E，11Z-C18：2-HSL，伴随有9-C18：1-HSL和2,9-C16：2-HSL各4％。虽然LuxI 2和LuxI 3的天然底物由于它们的低浓度而未被检测到，但它们在大肠杆菌中的过表达导致产生7：Z -14：1-HSL和C14：0-HSL 的6：1混合物。对于LuxI 2而言，LuxI 3 没有AHL形成[10]。AHL在链长和不饱和度方面的差异促使我们研究了LuxI型酶在玫瑰杆菌中的酰基链选择性。酶对特定的酰基链前体是否具有固有的选择性，或者它是否与每种可用的酰基前体无反应地反应？在后一种情况下，酰基前体的存在将决定最终AHL的结构。为了回答这个问题，确定了天然玫瑰杆菌的脂肪酸组成，并与产生的AHL进行了比较。此外，LuxI型酶在大肠杆菌中异源表达，纯化的重组酶用不同的前体进行测试以探测其选择性。Roseobacter组的两种模式生物，研究了P. inhibitens（以前的P. gallaeciensis [25]）DSM17395和Dinoroseobacter shibae DFL-12，以及密切相关的P. inhibitorens菌株T5和2.10 [26]，以研究菌株变异性。以前，已经表征了来自P. inhibitorns DSM 17395 的LuxI同源物PgaI 1，产生R -3-OH-C10：0-HSL [15,27]。该菌株还产生了长链AHL，如C18：1-HSL [9]，并含有第二个AHL合酶，PgaI 2 [28] ，可能涉及长链AHL的生物合成。在这里，我们PGAI的鉴定报告2从P. inhibens和鲁西1和的LuxI 2从D. shibae通过体外培养试验。