聚糖是生物必需的化合物，具有多种结构和功能作用。酶促合成是生产特定聚糖的重要方法，无需化学方法所需的费力的保护基。

糖苷磷酸化酶（GPases）是一类特殊的碳水化合物活性酶，使用糖-1-磷酸盐作为能量供体，可以绕过核苷酸糖的需求，降低了成本，并且可以从实验室体系扩展到工业生产上。

虽然 GPases 可以绕过核苷酸糖的需求，但是对于 ATP 驱动激酶的依赖仍然是一个成本问题。在这项研究中，作者利用糖-1-激酶（S1K）和 7 个 GPase，与 PolyP/PPK 介导的 ATP 再生偶联，建立了一系列一锅三酶系统（图 1）。该系统无需外加 ATP，利用 GPase 的立体选择性，能够高效地合成多种结构的寡糖，并且消除了对外源三磷酸核苷酸的依赖。

图 1. GPase、S1K 和 PPK 偶联催化低聚糖的一锅三酶合成。

图 2. LNB（Galβ1-3GlcNAc，1）和 GNB（Galβ1-3GalNAc，2）的一锅三酶合成。

结果表明，随着 PolyP 浓度的增加，LNB 的产率逐渐增加（图 3A），在 20  mM 后基本保持不变，因此 PolyP 的浓度选择 20 mM，同样地将 MgCl₂ 的浓度确定为 20 mM（图 3B）。随后，作者测试了 ATP 浓度对反应产率的影响（图 3C）。结果表明，即使在 ATP 浓度仅为 0.1 mM（0.0022 当量）时，产率仍可达到最大产率的 79%，表明在辅因子再生系统的存在下，极低的 ATP 浓度也可以支持反应的进行。ATP 浓度为 2 mM 时产率最高，进一步增加浓度也不利于转化，因此 ATP 的浓度选择 2 mM。最后，由于 EbPPK 可以将 AMP 和 ADP 转化为 ATP，作者测试了这三种辅因子对反应的产率的影响，结果发现并无显著差异（图 3D）。出于成本考虑，作者在后续实验中使用 AMP 作为起始辅因子。

相比此前的方法，该方法可以利用更高的底物浓度，仅使用 2 mM 的 AMP（0.044 当量），显着降低了底物的成本，并且保持了原有的产率。

图 3. LNB 合成条件的优化。

接下来，作者将 EbPPK 介导的 ATP 再生与多种甘露糖苷磷酸化酶（MPases）偶联，开发了一种简化的一锅系统，可以直接通过单糖和多磷酸盐合成多种 β-甘露糖苷。

以 β-1,2-甘露三糖为例，通过TXMPase、NahK 和 EbPPK 合成，经过分离纯化后，产率为 40%。相比于之前报道的 NahK/TXMPase 系统（产率为 57%），产率有所下降，但是以 0.013 当量的 AMP 替代了 1.0 当量的 ATP，大大降低了成本，同时底物浓度增加了 5 倍以上，显着增强了实用性，提高了扩展到生产上的适用性。

图 4. β-甘露糖苷的一锅三酶合成。

最后，作者利用 VpCPase、NahK 与 EbPPK，合成 N,N'-二乙酰壳二糖，产率为 52%（图 5）。以 GlcNAc 和 PolyP 为主要底物，以 AMP 作为起始辅因子，实现了 N,N'-二乙酰壳二糖的克级生产。

对于叠氮化物，以化学合成的 GlcNAcβEthN₃ 为受体底物反应，产率可达 51%。继续以该叠氮化物为受体，通过一锅三酶甘露糖基化系统进一步合成了 N-聚糖核心三糖—— Manβ1–4GlcNAcβ1–4GlcNAcβEthN₃)，产率可达 40%，与先前需要外源 ATP 和糖-1-磷酸的方法的产率相当。

图 5. N,N'-二乙酰壳二糖（GlcNAcβ1–4GlcNAc，9；GlcNAcβ1–4GlcNAcβEthN₃，10）和 N-聚糖核心三糖（Manβ1–4GlcNAcβ1–4GlcNAcβEthN₃，11）的一锅三酶合成。

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文章作者：CXY

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00567