分享一篇发表在Nature Methods上的文章：CaBLAM: a high-contrast bioluminescent Ca2+ indicator derived from an engineered Oplophorus gracilirostris luciferase，通讯作者是来自加州大学圣地亚哥分校的Nathan C. Shaner教授，该课题组的研究方向是荧光探针、传感器、成像等。

基因编码钙指示剂（GECI）是现代神经科学的核心工具，但荧光型（GCaMP、GECO 系列）依赖高强度激发光，带来光漂白、光毒性、背景自发荧光及硬件束缚，限制成像与自由活动实验。生物发光（BL）GECI 无需激发光，理论上可消除上述缺陷，但现有的BL-GECI存在两个缺陷：1）基线发光高，动态范围仅2–4 倍；2）Ca²⁺亲和力过高或过低，对生理浓度（50–1000 nM）不敏感。因此，该领域内尚无性能可与“金标准”GCaMP8比肩的BL探针。

为了克服以上困难，作者重新开发了一个高对比度生物发光Ca2+指示剂CaBLAM（Calcium Bioluminescence Activity Monitor）。简而言之，作者首先以深海虾Oplophorus gracilirostris荧光素酶（OLuc）变体eKAZ为模板，以提高发光强度与可溶性。通过交替使用易错PCR与定点饱和突变，通过定向进化获得高活性、高可溶性、易融合的新骨架SSLuc。

随后，作者需要进行传感器拓扑构建，他们在SSLuc末段β-折叠环处拆分，插入Ca²⁺感知模块RS20–CaM（钙调蛋白结合肽-钙调蛋白）。该“分裂-互补”策略使钙结合引起的构象变化直接调控荧光素酶活性。此外，作者还进行了亲和力与对比度并行优化。替换CaM序列为 GCaMP6s 来源，引入天然突变N98I降低亲和力；通过EF-hand额外突变得到Kd≈440 nM 的主版本（CaBLAM），并衍生出280 nM（332W）与3 µM（294W）版本，覆盖不同钙动态范围。作者还系统性筛选了120条C-端短肽（自抑制肽），发现低亲和肽VTGYRLLEEISN可最大限度放大“关-开”差异，使体外绝对对比度达83倍（饱和钙 vs 零钙），为现有BL-GECI 最高值。

作者在细胞水平上对传感器的性能进行了验证，并把它用在大鼠海马体神经元中，比较CaBLAM与最先进的荧光传感器GCaMP8s的性能差异。作者计算了CaBLAM诱发的生物发光变化，显示其可靠地报告了细胞内Ca2+的变化，且ΔL/L信号发生了显著变化。对于 GCaMP8s，尽管GCaMP8s整体更明亮，但是它荧光的基线很高，变化量（ΔF/F）较少。这说明了CaBLAM具有更高的信噪比。

最后，作者还在小鼠和斑马鱼中进行了尝试，在清醒、行为正常的动物中持续数小时成像。

总而言之，本文作者开发了新型钙离子指示器CaBLAM，补充了钙成像的工具箱。

本文作者：MB

责任编辑：LZ

DOI：10.1038/s41592-025-02972-0

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-025-02972-0