由于多病同治、多药同用案例的不断增多，基于药物-药物间相互作用（drug-druginteractions，DDI）已成为不良反应产生的重要原因之一。DDI改变了药物原来的体内过程，产生了单种药物用药所没有的不良反应^[1]。在人体的内源与外源性代谢中，细胞色素P450（cytochrome P450，P450）酶起着至关重要的作用。P450酶的诱导和抑制是改变药物生物转化反应最常见的2种原因。诱导性相互作用可以导致药效的降低甚至丧失，也可因酶活性的增高而产生代谢物毒性，引起严重的不良反应^[2-3]。因此预测基于P450酶的诱导作用是新药研发中评价候选药物特性的重要内容。

小白菊内酯（parthenolide，PTL）是野生甘菊 Tanacetum parthenium (L.)Sch. Bip. 的主要提取成分，它是一种倍半萜烯内酯类（sesquiterpene lactones，SLs）化合物 ^[4]。近年来研究发现小白菊内酯除抗炎外，还具有抗肿瘤的功效，对急性髓细胞白血病、恶性胶质瘤、前列腺癌等多种癌症具有治疗作用^[4-7]。ACT001是在对大量PTL结构修饰化合物及衍生物进行筛选的基础上发现的1个能选择性消除癌症干细胞的高活性化合物^[8]，为11βH,13-二甲基氨基含笑内酯的富马酸盐，母核为愈创木烷型倍半萜烯内酯，分子式为C₂₁H₃₁NO₇^[9]，结构见图1，现已作为抗脑胶质瘤一类新药进入临床研究阶段。

本研究应用冷冻的原代人肝贴壁细胞进行接种培养，使用ACT001分别对细胞色素氧化酶（CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4）进行诱导，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定P450酶mRNA表达水平，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法测定P450酶活力，评价ACT001对P450酶的诱导潜能，为ACT001的临床研究及合理用药提供参考。

1  材料

1.1  细胞

冷冻原代人肝贴壁细胞HC4-15（简写为HC4）、HC10-10（简写为HC10）及HC1-34（简写为HC1）购自Xenotech公司。

1.2  仪器

HERAcell 150i二氧化碳培养箱、Sorvall Legend Micro 17R高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；AB54-S型分析天平[德国梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Mastercycler ep Realplex²实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪、微量移液枪（德国Eppendorf公司）；CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）；L500低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；ZHWY型恒温振荡器（北京华威兴业科技有限公司）；TC-96/G/H（b）C型基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）。

1.3  药品与试剂

ACT001（批号20120704，质量分数99.2%）由天津尚德药缘科技有限公司提供；注射用奥美拉唑钠购自常州四药制药有限公司（批号20150130D1）；利福平、红霉素购自MCE公司；苯巴比妥钠购自北京索莱宝科技有限公司；地塞米松磷酸钠注射液购自湖北天药药业股份有限公司；非那西丁购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；睾酮购自Acros公司；对照品对乙酰氨基酚（批号100018-200408，质量分数＞99%）购自中国食品药品检定研究院；对照品羟基安非他酮（批号59887）、6β-羟基睾酮（批号47083），质量分数＞99%，均购自BD公司；内标吲达帕胺（批号Y0703003，质量分数＞99%）购自天津力生制药股份有限公司。

Williams’ E培养基、胰岛素-转铁因子-硒补充剂（100×）、青链霉素混合液（100×）、磷酸盐缓冲液（PBS，1×）、含EDTA的0.25%胰酶、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；I型胶原包被48孔培养板购自Corning公司；DEPC水购自北京索莱宝科技有限公司；TRNzol Reagent购自天根生化科技（北京）有限公司；逆转录试剂盒TranscriptorFirst Strand cDNA Synthesis kit和qRT-PCR试剂盒Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）均购自Roche公司；qRT-PCR引物购自深圳华大基因科技有限公司。

2  方法

2.1  肝细胞培养基的配制

无血清培养基：在Williams’ E培养基中添加0.5%胰岛素-转铁因子-硒补充剂、1%青链霉素混合液（100×）和50 ng/mL的地塞米松磷酸钠。含血清培养基：在无血清培养基中加入10% FBS。

2.2  ACT001对P450酶的诱导

将肝细胞冻存管从液氮罐中取出，立即放入39 ℃恒温水浴锅中快速晃动使冻存液快速融化，于超净工作台中将细胞悬液移入离心管，加入37 ℃预温的无血清培养液，离心弃去上清液，以含10% FBS的培养液悬浮细胞，接种于胶原蛋白包被的48孔培养板中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。3～6 h后更换无血清培养基。24 h后，阳性对照组分别更换含20μmol/L利福平（CYP3A4诱导剂）、50 μmol/L奥美拉唑（CYP1A2诱导剂）和1 mmol/L苯巴比妥钠（CYP2B6诱导剂）的培养基；阴性对照组为含10 μmol/L红霉素的培养基；对照组为空白无血清的培养基^[10]；实验组为分别含ACT001 1、6、30 μmol/L的培养基。每组3个复孔。24 h后更换1次相同的培养基。细胞与诱导剂作用时间为48 h。

2.3  qRT-PCR测定肝细胞中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 mRNA表达水平

完成诱导的肝细胞24孔用PBS洗涤1次，按TRNzol总RNA提取试剂盒说明书及Roche公司Transcriptor First Strand cDNASynthesis kit逆转录试剂盒说明书，提取肝细胞的总RNA并逆转录为cDNA。以逆转录的cDNA为模板，qRT-PCR反应体系为Fast Start Universal SYBR GreenMaster（Rox）25 μL、下游引物（10 μmol/L）1.5 μL、上游引物（10 μmol/L）1.5 μL、水（PCR-grade）18 μL、cDNA模板4 μL，总体积 50 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环，60～95 ℃熔解曲线分析。引物序列见表1。

相对mRNA表达量计算（Livak法）同时测定样品中目标基因（CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4）和内参基因（β-actin）的C_t值，采用2^−ΔΔCt计算受试药品组细胞的CYP基因与对照组细胞CYP基因比较的相对表达量。

2.4  LC-MS/MS测定肝细胞中CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4酶活力

2.4.1  LC-MS/MS测定条件  色谱柱：Diamonsil C₁₈（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-甲酸铵（20 mmol/L，含0.1%甲酸）（65∶35）；柱温35 ℃；体积流量0.5 mL/min；进样器温度4 ℃；进样体积5 μL。离子化源：电喷雾离子化源，正离子检测；离子喷雾电压4 500 V；温度600 ℃；卷帘气138 kPa；喷雾气345 kPa；加热气586 kPa；碰撞气69 kPa。扫描方式：多反应监测。

2.4.2  对照品溶液的制备  取羟基安非他酮、对乙酰氨基酚、6β-羟睾酮对照品适量，以甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL贮备液I。分别吸取100 µL各贮备液I于10 mL量瓶中，定容得质量浓度为10 μg/mL贮备液II；分别取羟基安非他酮、对乙酰氨基酚、6β-羟睾酮贮备液II 1.890、0.639、7.610 mL配制成混合对照品贮备液；随后用甲醇梯度稀释，得到系列混合对照品溶液。

2.4.3  内标溶液配制  精密称取吲达帕胺10 mg，置于10 mL量瓶中，定容，混合均匀得1 mg/mL内标贮备液I。精密吸取内标贮备液I 0.1 mL，置于10 mL量瓶中，定容，混匀得10µg/mL内标储备液II。精密吸取5 mL内标贮备液II至500 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，稀释为100 ng/mL的内标溶液。

2.4.4  肝细胞培养的上清液样品处理  完成诱导的肝细胞24孔用PBS洗涤1次，以“Cocktail”法混合加入CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的探针底物（100 μmol/L非那西丁、200 μmol/L睾酮、100 μmol/L安非他酮）进行反应，37 ℃反应1 h，取100 μL肝细胞培养上清液（或空白肝细胞培养液）中加入甲醇100 μL（或混合对照品溶液）及内标吲达帕胺溶液（100 ng/mL，甲醇配制）200 μL，涡旋2 min混匀，低温12 000 r/min离心10 min，分取上层有机相，进样5 μL，进行LC/MS/MS分析，同时测定上述探针底物经CYP同工酶代谢的产物（对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、6β-羟基睾酮）浓度。分别使用3个批次的肝细胞重复此实验。

使用Analyst 1.5.2数据处理软件，分别对对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、6β-羟睾酮和内标吲达帕胺进行积分，得出峰面积。以各代谢产物浓度为横坐标（X），各代谢产物与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），用加权最小二乘法（权重为1/x²）进行回归运算，求得的直线回归方程即为校正曲线。经校正曲线计算当日所测的各代谢产物浓度，用于定量分析人肝细胞CYP酶代谢探针底物产生的代谢产物生成量。人肝细胞CYP同工酶的活性以各代谢产物的浓度来衡量。

酶活力＝代谢产物浓度×代谢产物体积/反应时间

2.4.5  方法学考察

（1）线性范围：按照“2.4.1”项下条件，测定对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、6β-羟睾酮浓度的线性范围分别为6.61～6 614、1.56～782、13.1～13 139 nmol/L。

（2）准确度和精密度：在低、中、高浓度下，对乙酰氨基酚、羟基安非他酮、6β-羟睾酮的准确度分别在−6.90%～5.07%、−7.59%～4.26%、−2.42%～7.17%，批内精密度分别小于2.41%、2.16%、3.39%，符合生物制品分析方法验证要求。

（3）绝对基质效应：在实验选择的样品处理、色谱与质谱条件下，对乙酰氨基酚在低、中、高3个浓度水平上的绝对基质效应分别为（53.10±3.24）%、（52.30±3.03）%、（55.30±1.06）%；羟基安非他酮在低、中、高3个浓度水平上的绝对基质效应分别为（94.90±10.70）%、（99.50±2.59）%、（98.70±1.73）%；6β-羟睾酮在低、中、高3个浓度水平上的绝对基质效应分别为（104.00±9.40）%、（108.00±3.19）%、（111.00±2.33）%；内标的基质效应为（104.00±1.19）%。

（4）提取回收率：提取回收率的结果表明，对乙酰氨基酚在低、中、高3个浓度水平上的回收率分别为（100.00±5.43）%、（101.00±1.80）%、（98.80±1.49）%；羟基安非他酮在低、中、高3个浓度水平上的回收率分别为（103.00±6.57）%、（96.90±2.05）%、（95.70±1.63）%；6β-羟睾酮在低、中、高3个浓度水平上的回收率分别为（98.40±13.50）%、（99.50±2.94）%、（95.60±3.52）%；内标的回收率为（99.00±1.24）%，均良好。

2.5  数据处理

参照美国FDA 2012年发布的《药物相互作用研究指导原则草案》将阳性对照组与对照组进行比较，CYP基因mRNA表达量提高4倍以上、CYP基因酶活性提高2倍以上表明阳性对照组的诱导模型建模成功^[10]。以实验组相对于阳性诱导剂组的mRNA表达量或酶活力百分比（Er）评价ACT001对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的诱导潜能，Er≥40%可判定为受试药具有酶诱导潜能。

Er＝(C_药物―C_对照)/(C_阳性对照―C_对照)

C_药物、C_对照和C_阳性对照分别代表受试组、对照组和阳性对照组CYP mRNA表达量或探针底物代谢产物生成量

3  结果

3.1  qRT-PCR法检测ACT001对P450酶的诱导作用

在HC4、HC10及HC1细胞中，与对照组比较，奥美拉唑、苯巴比妥钠、利福平均能显著诱导CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 mRNA的表达，表达量提高均在4倍以上；阴性对照红霉素对CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 mRNA表达水平未见明显影响。上述数据表明P450酶诱导模型建立成功，结果见表2。

与对照组比较，ACT001 1、6 μmol/L组细胞CYP1A2 mRNA表达水平未见明显变化，ACT001 30 μmol/L组细胞CYP1A2 mRNA表达水平显著降低。随着ACT001浓度的增加，细胞中CYP2B6mRNA表达水平逐渐升高，在30μmol/L时CYP2B6 mRNA表达水平显著升高，均超过对照组的7倍，接近甚至超过阳性诱导剂苯巴比妥钠的诱导倍数，推测ACT001对CYP2B6存在诱导潜能。ACT001 1 μmol/L组细胞CYP3A4 mRNA表达水平显著升高，均超过对照组的4倍，但未达到阳性诱导剂利福平诱导倍数的40%，随着浓度的增加CYP3A4 mRNA表达水平逐渐降低，推测ACT001对CYP3A4没有诱导潜能。结果见表2。

3.2  LC-MS/MS法检测ACT001对P450酶的诱导作用

在HC4、HC10及HC1细胞中，与对照组比较，奥美拉唑、苯巴比妥钠、利福平均能明显诱导CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4表达，表现出对应的酶活力明显增加，均＞2。阴性对照红霉素对CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4表达水平未见明显影响。结果见表3。

与对照组比较，ACT001 1、6 μmol/L组CYP1A2的酶活性未见明显变化，ACT001 30 μmol/L组细胞CYP1A2酶活力虽出现下降趋势，但不如mRNA表达水平下降明显，推测ACT001对CYP1A2没有诱导潜能；随着ACT001浓度的增加，细胞中CYP2B6的酶活性逐渐升高，在30 μmol/L时CYP2B6的酶活性增加均大于4倍，超过苯巴比妥钠的诱导倍数的40%，推测ACT001对CYP2B6存在诱导潜能。ACT001各浓度组细胞中CYP3A4的酶活力未出现明显升高，均小于对照组的2倍，推测ACT001对CYP3A4没有诱导潜能。结果见表3。

4  讨论

P450酶对诱导剂的反应存在明显的种属差异^[3]，人原代培养肝细胞的代谢处理系统基本保留了正常组织内的细胞活性，能全面反映药物进入人体内的真实状态，因此被认为是P450酶诱导实验的金标准，并被FDA认证为有效的诱导评价工具^[11]。随着人原代肝细胞的商业化，它被越来越多的药物临床前P450酶诱导研究所使用。

美国FDA 2012年发布的《药物相互作用研究指导原则草案》及国家食品药品监督管理总局（CFDA）在2014年颁布的《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》^[12]中指出体外诱导实验可通过测定相关mRNA表达或酶活性的变化进行评价药物对P450酶的诱导作用。用qRT-PCR测定P450酶mRNA表达水平可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，具有宽的动态范围和高的灵敏度，但以mRNA为评价指标时易高估体内的DDI^[13]。用LC-MS/MS法测定P450酶活力可以规避高估问题，真实、直接地反映药物诱导CYP酶对活性的影响，但该法存在的不足是受试药对P450酶有较强的抑制作用时，有可能掩盖其对酶的诱导潜能。通常转录水平和酶活性之间有较好的相关性，但在受试药既是酶抑制剂又是酶诱导剂的情况下，对酶的最终效应则取决于抑制和诱导的程度及用药的时程，最初的表现可能是酶的抑制，随着新蛋白的合成，酶的诱导作用才逐渐显现出来^[14-15]。因此开展酶诱导研究时，同时测定mRNA表达水平和酶活力的变化，可排除受试物及其代谢产物的酶抑制作用对酶诱导作用等干扰因素的影响，获得更为可靠的结果和合理的解释。但联合mRNA表达水平及酶活力的变化来共同研究药物对P450酶的诱导作用，在国内尚无文献报道。

通常情况下，体外酶诱导实验的浓度点设置主要参考临床前动物体内有效剂量下的血药浓度情况，若同时有不同动物的血药浓度，以大动物为准。在保证无毒性的前提下，药物浓度应比体内C_max高1个数量级。ACT001为抗癌药，可能具有一定的细胞毒性，因此，本研究首先进行了ACT001对人肝细胞的预实验。参照ACT001的Beagle犬体内数据及对癌细胞的体外活性抑制数据，预实验浓度设定为1、6、30、100 μmol/L。预实验结果显示ACT001在1、6、30 μmol/L时，人肝细胞形态没有显著性变化，在100 μmol/L时，人肝细胞出现明显的脱落凋亡，说明对细胞有明显毒性，故最终诱导实验浓度设定为1、6、30 μmol/L。

本研究发现ACT001对CYP1A2、CYP3A4没有诱导潜能，对CYP2B6存在诱导作用，诱导能力接近甚至超过阳性诱导剂苯巴比妥钠。ACT001已作为抗脑胶质瘤一类新药进入临床研究阶段，在临床使用时可能会与其他抗癌药联合使用。如果联合使用的药物为CYP2B6的底物如抗癌药环磷酰胺或异环磷酰胺，可能会发生因ACT001对CYP2B6的诱导致使环磷酰胺或异环磷酰胺的代谢加快，从而降低环磷酰胺或异环磷酰胺的药效。但本研究为体外酶诱导研究，还需进一步实验验证。

参考文献（略） 

来  源：慈小燕，谷  元，李  薇，武卫党，伊秀林，曾  勇，司端运，陈  悦. 小白菊内酯衍生物ACT001对P450酶的诱导作用研究 [J]. 中草药, 2019, 50(6):1424-1429.