白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种多酚类物质，又名(E)-3,5,4-三羟基二苯乙烯，分子式为C₁₄H₁₂O₃。Res存在于虎杖、葡萄、蓝莓等植物中，具有抗肿瘤、抗心血管疾病及抗氧化等作用^[1-4]，可以作为食品添加剂和抗肿瘤药物开发的原料，被称为继紫杉醇之后的新一代天然抗肿瘤药物。研究发现，Res可通过调节相关分子靶点来控制肿瘤细胞的侵袭与转移^[5-6]。Res具备众多的药理活性及实用价值而得到广泛关注，但Res是脂溶性药物，水溶性差，靶向性不强，靶部位几乎不能达到有效治疗浓度，影响药效的发挥。想要充分发挥Res的药用价值，则需要弥补其缺点。

目前研究主要为Res的微/纳米系统，如固体脂质纳米粒子、微囊、微球和环糊精包合物等^[1,7]。这些研究都是通过改变剂型从而使Res的体内生物利用度和体内代谢情况得到改善。聚酰胺-胺（polyamido-amine，PAMAM）树状大分子是一种人工合成的新型纳米级大分子化合物，具有高度对称、无免疫原性及良好的生物相容性等优点^[8]，内部空腔的包载是其主要载药方式之一^[9]。在现有的研究中，PAMAM已经被广泛应用在许多方面，主要包括纳米药物及基因载体、免疫诊断纳米试剂、纳米疫苗和核磁共振造影剂等。目前PAMAM已成为抗癌、抗炎、抗病毒药物研究最多的载体，基于PAMAM的药物递送系统具有良好肿瘤靶向性、载药量高、水溶性强以及细胞毒性低等显著优点^[10]，本实验采用发散法合成4.0代PAMAM大分子载体材料，并进行乙酰化。再通过逆相蒸发法制备PAMAM-Ac包载Res的新型载药系统Res- PAMAM-Ac。考察其形态特征、理化性质和细胞毒性，以期提高Res的治疗效果。

1  材料与仪器

1.1  仪器

RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；HWCL-3型恒温磁力搅拌仪、SHB-3型循环水式真空泵，郑州长城工贸有限公司；Agilent 1260- API500型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；FTIR- 8400s型红外光谱仪，日本Shimadzu公司；赛多利斯BSA224S型万分之一电子天平，德国赛多利斯公司；ZEN3690型激光粒度分析仪，英国马尔文公司；Kinetex C₁₈色谱柱，美国菲罗门公司；FDU型冻干机，日本东京理化器械株式会社；ZD-85型恒温气浴振荡器，常州荣华仪器制造有限公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；0.22 μm微孔滤膜，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2  药品与试剂

乙二胺（EDA），成都艾科达化学试剂有限公司；丙烯酸甲酯（MA），山东西亚化学试剂股份公司；乙酸酐（Ac），天津天大化工实验厂；三乙胺（TEA），北京百灵威科技有限公司；Res原料药，上海思域化工科技有限公司，批号B1807119，质量分数99%；二甲基亚砜（DMSO），天津市津东天正精细化学试剂厂；甲醇，优级纯试剂，天津市津东天正精细化学试剂厂；DMEM培养基，美国Mediatech公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、100%灭活胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、人肺癌A549细胞由华北理工大学医学实验研究中心提供；SD大鼠，由华北理工大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（京）2014-0004。

2  方法与结果

2.1  PAMAM的合成与纯化

PAMAM以乙二胺为核，其末端的2个氨基与丙烯酸甲酯进行迈克尔加成反应制备0.5代PAMAM，之后再与乙二胺进行酰胺化反应形成末端为氨基的1.0代PAMAM，反复进行以上步骤合成4.0代的粗产品PAMAM，产率为76.4%。PAMAM G4.0的合成过程见图1。因残存的未反应的乙二胺和丙烯酸甲酯会影响PAMAM合成的完整性，故反应结束后采用减压蒸馏的方式除去杂质。充分超声后再用透析法对产物进一步纯化，将粗品溶于适量的蒸馏水并装入截留相对分子质量6 000的透析袋中，用大量蒸馏水透析24h，将产物的水溶液用0.22μm微孔滤膜滤过后冷冻干燥，得到纯品PAMAM G4.0，产率为70.7%。

2.2  PAMAM-Ac载体材料的制备与纯化

称取1.00 g PAMAM G4.0溶于100 mL无水甲醇，加入0.5 mL三乙胺，混匀。再取0.3 mL乙酸酐和60 mL无水甲醇混匀后置于恒压滴液漏斗中，逐滴加入到上述溶液，室温搅拌过夜。PAMAM-Ac G4.0的合成过程见图2。反应结束后减压蒸馏除去甲醇，选用截留相对分子质量为6 000的透析袋透析24 h后得到PAMAM-Ac G4.0载体材料。

2.3  PAMAM-Ac G4.0载体材料的表征

2.3.1 核磁共振氢谱（¹H-NMR）检测及结果  以氘代氯仿（CDCl₃）为溶剂，对PAMAM G4.0和PAMAM-Ac G4.0进行¹H-NMR分析。结果（图3）显示PAMAM G4.0在δ 1.932处存在s峰，说明有-RNH上的H的吸收峰；δ 3.219～3.254处有-NH- CH₂-的H吸收峰；δ2.702～2.777处为多峰，说明有=NCH₂CH₂-的吸收峰。与PAMAM G4.0的¹H-NMR相比，PAMAM-Ac G4.0在δ 1.866处出现了s峰，其为酰胺键-CO-NH-的H吸收峰，PAMAM-Ac G4.0在δ 2.870处有明显的乙酰基-CO-CH₃吸收峰。

2.3.2 红外光谱检测及结果  采用红外光谱检测法对PAMAM G4.0和PAMAM-Ac G4.0进行表征，结果（图4）显示在3 283.14 cm⁻¹处存在-NH₂的吸收峰；2 937.21 cm⁻¹和2 871.17 cm⁻¹处分别是-CH₂-对称伸缩振动和不对称伸缩振动的特征吸收峰；在1 645.50 cm⁻¹和1 558.25 cm⁻¹出现-CO-NH-的特征吸收峰。

2.3.3  平均粒径、Zeta电位考察及结果  分别称取0.20 mg PAMAM G4.0和PAMAM-Ac G4.0载体材料溶于1 mL甲醇，利用马尔文激光粒度分析仪在25 ℃下检测粒径和Zeta电位，测得PAMAM G4.0载体的平均粒径为（8.00±1.30）nm，PDI为0.119±0.031，Zeta电位为（1.19±0.40）mV；PAMAM-Ac G4.0载体的平均粒径为（8.07±0.71）nm，PDI为0.121±0.010，Zeta电位为（−6.06±1.84）mV。

2.4  Res-PAMAM-Ac的制备及表征

2.4.1  Res-PAMAM-Ac的制备 称取PAMAM-AcG4.0 1.00 g置于10 mL离心管中，用10 mL甲醇充分溶解后，再加入1.00 g（过量）Res，在25 ℃下，恒温振荡72 h。反应停止后加入10 mL纯水，逆相蒸发除去有机相，将溶于水的复合物与不溶于水的Res进行抽滤分离，滤液冷冻干燥后即得Res- PAMAM-Ac复合物。

2.4.2  色谱条件  色谱柱Diamonsil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；柱温30 ℃；流动相乙腈-水溶液（体积比为30∶70）；体积流量1 mL/min；紫外检测波长306 nm；进样量10 μL；检测时间15 min。Res保留时间8.2～9.5 min。

2.4.3 线性关系考察  取Res原料药溶于甲醇溶液配制质量浓度为0.5 mg/mL的储备液，量取储备液稀释制得质量浓度分别为250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL的Res（甲醇溶液）对照品。取储备液及各质量浓度样品1 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过后按“2.4.1”项色谱条件置于高效液相色谱仪检测，记录峰面积（Y），得到关于峰面积和质量浓度的线性回归方程Y＝73 248 X＋238.46，r²＝0.999 3。Res在质量浓度为10～250 μg/mL时与峰面积线性关系良好。

2.4.4 方法学考察  取Res-PAMAM-Ac G4.0和Res原料药，用甲醇溶液配制成300.0、150.0、50.0 μg/mL的高、中、低3种质量浓度，利用高效液相色谱仪在同天内每个质量浓度测量5次得到日内精密度；连续测定5d，得日间精密度。结果日内和日间RSD值分别为7.84%、5.99%、8.55%和3.99%、5.71%、9.35%（n＝5）。取Res-PAMAM-Ac G4.0和Res原料药，用纯水配制成30、25、20 μg/mL的高、中、低3个质量浓度，25 ℃恒温振荡72 h，经冷冻干燥除水后用甲醇定容，之后过0.22 μm微孔滤膜按“2.4.2”项色谱条件检测，测得高、中、低质量浓度回收率分别为（92.67±1.60）%、（98.36±4.44）%、（99.75±5.31）%（n＝3）。其日内、日间精密度及回收率均满足实验要求。

2.4.5 载药量的测定  采用甲醇浸提法测定复合物的载药量，将一定量的复合物用甲醇溶解，超声充分浸提，按“2.4.2”项色谱条件检测，由回归方程算得复合物中药物质量浓度，进而计算载药量。

载药量＝W₁/W₂

W₁为复合物中Res质量，W₂为复合物质量

2.4.6  反应时间对载药量的影响  取PAMAM-Ac G4.0用甲醇溶解配制质量浓度为5 mg/mL的8份样品，均加入100 mgRes原料药，置于25 ℃恒温气浴振荡器中，每隔9 h取出1份样品加入等量的纯水，逆相蒸发除去有机相，抽滤并将滤液冷冻干燥后加入1 mL甲醇复溶，超声后按“2.4.2”项色谱条件检测，每份重复测定5组，结果代入回归方程。按“2.4.5”公式计算药物含量，结果（表1）显示PAMAM G4.0在63 h后载药量逐渐趋于平稳。

表1 载药量随反应时间的变化 (±s, n = 5)

Table1  Drugloadingvarieswithreactiontime(±s,n=5)

2.4.7  pH值对载药量的影响  取PAMAM-Ac G4.0用甲醇溶解配制质量浓度为1 mg/mL的5份样品。由于PAMAM-Ac表面含有大量-NH₂，检测pH值为10，所以先用稀盐酸调节各组pH值至5、6、7、8、9，再分别加入50 mgRes原料药，置于25 ℃恒温气浴振荡器中，72 h后取出加入等量纯水，逆相蒸发除去有机相，抽滤并将滤液冷冻干燥后加入1mL甲醇复溶，超声后按“2.4.2”项色谱条件检测，平行测定5组，结果代入回归方程，根据“2.4.5”项公式计算载药量。结果如表2所示，平均载药量达到（76.99±1.30）mg/g（n＝5）。

2.4.8  Res-PAMAM-Ac平均粒径、Zeta电位检测及结果  配制Res-PAMAM-Ac水溶液10 mg/mL，超声20 min，利用马尔文粒径检测仪检测，测得Res- PAMAM-Ac平均粒径为（167.30±21.70）nm，PDI为0.115±0.006，Zeta电位为（19.27±0.35）mV。由结果可知，随着乙酰化和药物的包载，分散体系逐步趋向稳定。

2.4.9  包封率测定及结果  采用透析法测定纳米载体的包封率，取Res-PAMAM-Ac，用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解配制质量浓度为1mg/mL的储备液，取2 mL储备液稀释数倍后置于截留相对分子质量为 6 000的透析袋，并在400 mL的PBS中透析，24 h后收集透析液并定容，按“2.4.2”项色谱条件检测游离药物含量，由公式算得Res-PAMAM-Ac包封率为（29.63±2.70）%（n＝5）。

包封率＝(W₀－W₁)/W₀

W₀为药物总量，W₁为游离药物量

2.5  细胞毒性实验

由于肿瘤细胞较正常细胞对于毒性更加敏   感^[11]，所以本实验选用人肺癌A549细胞，并采用MTT法分别考察PAMAM、PAMAM-Ac空白载体和Res-PAMAM-Ac含药载体对人肺癌A549细胞的细胞毒性。取对数生长期的人肺癌A549细胞以6×10³个/孔接种于96孔板中，在37 ℃、5% CO₂环境中孵育24 h后弃去培养液。分别加入含2%血清的DEME培养基稀释的PAMAM、PAMAM-Ac空白 载体（浓度依次为0.005、0.01、0.1、1、10、20  μmol/L）^[7]和Res-PAMAM-Ac含药载体（质量浓度依次为1、10、30、50、100、200 μg/mL），每孔100 μL，每个浓度设置4个复孔，只加入细胞的DMEM培养基作为阴性对照。继续培养24 h，弃去含药培养液，用PBS清洗2次后，每孔加入5 mg/mL MTT试剂继续孵育30 min，然后吸去MTT试剂，加入DMSO溶液振荡摇匀，用酶标仪在490 nm处测定每孔的吸光度（A）值，并根据实验组和对照组A值的比值计算细胞存活率。实验重复3次。由结果（表3、4）可知，PAMAM空白载体在浓度为1 μmol/L时细胞毒性最小，乙酰化后的载体随着浓度的增大，细胞毒性逐渐增强，但在20μmol/L的条件下，细胞存活率依然接近100%，表明乙酰化的空白载体

表3  PAMAM G4.0、PAMAM-Ac G4.0对人肺癌A549细胞的毒性 (±s, n = 3)

Table3  ViabilitiesofA549cellsafterbeingtreatedwithPAMAMG4.0 andPAMAM-AcG4.0 (±s,n=3)

表4  Res-PAMAM-Ac对A549细胞的毒性 (±s, n =3)

Table4  ViabilitiesofA549cellsafterbeingtreatedwithRes-PAMAM-Ac (±s,n=3)

有较好的体外安全性。在相同浓度下，PAMAM对A549细胞的细胞毒性显著高于PAMAM-Ac，这表明乙酰化显著降低了其细胞毒性。含药载体的细胞毒性显示随着药物质量浓度的增加，各组含药载体对A549细胞的毒性逐渐增加。

2.6  溶血实验

采集SD大鼠眼球后静脉血液2 mL，置于抗凝采血管内，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，除去血清后加入0.9%生理盐水再次离心10 min，清洗下层的红细胞至上清液为无色。以0.9%生理盐水为稀释剂，制备2%红细胞悬液。将0.1 μmol/L PAMAM-Ac G4.0和30 μg/mL Res-PAMAM-Ac溶液与等体积的红细胞悬液混合，取空白血加0.9%生理盐水作为阴性对照，空白血加蒸馏水作为阳性对照。将样品置于37 ℃水浴中孵育1 h后，离心收集上清液测量样品在540 nm波长处的A值，计算溶血率（HR）^[12]。结果测得PAMAM-Ac G4.0和Res-PAMAM-Ac的溶血率仅为3.24%和2.05%（n＝3），符合《中国药典》2015年版对溶血率小于5%的要求。

HR＝(A₁－A₀)/(A₂－A₀)

A₀为阴性对照组吸光度，A₁为实验组吸光度，A₂为阳性对照组吸光度

2.7  稳定性考察

将制得的Res-PAMAM-Ac进行长期稳定性试验，放置条件为4 ℃、60 d，观察样品外观以及药物渗漏情况，并进行质量浓度检测。

将制得的Res-PAMAM-Ac进行加速离心实验（10 000 r/min，15 min），并在离心前后，分别用高效液相色谱仪测定在306 nm波长处的峰面积，根据公式计算稳定性参数（K_E）。

K_E＝(C₀－C)/C₀

C₀为纳米载体稀释液放置或离心前的药物质量浓度，C为纳米载体稀释液放置或离心后的药物质量浓度

作为评价纳米载体稳定性的指标，K_E愈小说明稳定性愈好^[13]，结果（表5、6）显示Res-PAMAM-Ac的长期K_E和加速离心K_E平均值分别为0.05和0.12，均小于0.15，说明纳米载药体系稳定性良好。

3  讨论

本实验以PAMAM为载体，利用其内部疏水空间包埋Res为载药方式合成Res-PAMAM-Ac纳米载药复合物。首先采用发散法合成PAMAM载体材料，在合成过程中随着PAMAM代数的增加，支链的长度和

来源：中国药学会系列期刊！