▲第一作者：张红梅，高宇；通讯作者：李梅
通讯单位：中国科学院生物物理研究所
论文DOI：10.1038/s41467-020-15268-y
长链脂肪烃是石油的主要成分,光合蓝藻是产生长链脂肪烃的重要工程菌。本研究首次从结构生物学的角度阐明了烷烃生物合成途径的催化过程和调控机理，为继续改造优化该途径提供了重要基础。随着地球上化石燃料日趋枯竭，寻求更安全、环保、经济的替代燃料成为社会发展的必须。长链脂肪烃作为传统液体燃料汽油的主要成分，对其生物合成途径进行改造和优化是极有前景的替代产油方案。早期的研究发现光合生物蓝藻中存在一条代谢途径，可以直接利用光能合成长链脂肪烃，无需额外碳源，但是效率较低，对该途径进行改造，获得能够高效产烃的蓝藻，是开发清洁生物能源的一条可行的途径。蓝藻中长链脂肪烃合成途径包括两步酶促反应（图1），分别由酰基载体蛋白还原酶（AAR,acyl-acyl carrier protein reductase）和脂肪醛脱甲酰加氧酶（ADO, aldehyde deformylating oxygenase）催化。其中AAR催化第一步反应，以携带酰基脂肪链的ACP（acyl carrier protein）蛋白或辅酶A（CoA）为底物，将之还原为长链脂肪醛，随后ADO以AAR的产物脂肪醛为底物，催化其生成为少一个碳的脂肪烃。研究表明，这两个酶单独都可完成各自的催化反应，但是之前的研究结果不能解释疏水的脂肪醛分子是如何在亲水环境中在两个水溶蛋白之间进行传递的；最近，有研究表明AAR和ADO可以形成复合物，且复合物的形成有利于催化反应的进行，但复合物的结构和对该途径的具体意义尚不清晰。此外，虽然本团队已于2015年解析了ADO的晶体结构，对其催化机制进行了深入的讨论，但是AAR的结构还未被解析，其催化过程和分子机理也没有阐述清楚。本研究利用结构生物学手段，证明了AAR和ADO可以形成复合物，而且在复合物内部形成一条贯穿两个酶的疏水通道，用于中间产物从AAR到ADO的传递，阐明了烷烃生物合成途径中AAR的催化机理以及整个途径的过程和调控机制。▲图1 蓝藻中由AAR和ADO催化的烷烃生物合成途径示意图。
继2015年在Protein & Cell发表了关于ADO的三维结构之后[1]，李梅课题组继续对蓝藻烷烃生物合成途径开展研究。通过对AAR蛋白单独结晶，以及对AAR、ADO和底物硬脂酰辅酶A（stearoyl-CoA）孵育后结晶等方式，解析了单独的AARapo结构，和3个结合了底物/辅因子的AAR-ADO复合物的结构。从AAR三维结构可以看出，AAR由三个结构域构成，分别为N端，C端和Mid结构域，整个分子呈心形，在分子中心是催化关键氨基酸C294, 它属于C端结构域（图2a）。C294上方有一个深“V”的裂口，是底物的入口。AAR和ADO形成复合物是通过AAR的N端结构域和ADO的第7段螺旋相互作用，AAR的N端螺旋(R73-H91)上有多个带正电荷的碱性氨基酸残基，它们和ADO的第7段螺旋上的带负电荷的酸性氨基酸残基之间形成静电相互作用（图2b & c），稳定了AAR-ADO复合物的结构。基于结构信息，研究人员分别突变了AAR和ADO蛋白中与复合物形成相关的氨基酸残基，发现突变体蛋白与ADO或AAR之间的相互作用都减弱或彻底丧失，从而通过结构数据和生化实验共同证实了AAR和ADO之间的相互作用面，以及形成复合物的关键氨基酸。▲图2 (a) AAR的晶体结构和AAR的表面切图，其中N端、mid和C端结构域分别以蓝紫色、黄色、洋红色展示；(b) AAR-ADO复合物结构，其中ADO以湖蓝色展示；(c) AAR-ADO相互作用细节分析。（2）AARthioester-ADO的结构是AAR处于催化中间态的结构通过将AAR、ADO与底物stearoyl-CoA共同孵育，研究人员获得了AARthioester-ADO的结构。结构中一条硬脂酰链(去掉了CoA头部的Stearoyl-CoA,图3a)位于由AAR的N端和C端结构域共同形成的疏水通道中，其脂酰链的第一个碳原子和C294的半胱氨酸的巯基之间形成了共价脂酰键（图3b & c）。在AAR催化Stearoyl-CoA为脂肪醛的过程中，结合于AAR的硬脂酰CoA会首先自发的断裂脂键，并与AAR的催化氨基酸C294上的巯基重建硫脂键，最终形成脂酰-酶的中间状态，AARthioester-ADO的结构正是代表了这种催化过程中的中间态。▲图3 (a) Stearoyl-CoA化学式；(b) AARthioeater-ADO结构中的底物（洋红色棍状表示）通道；(c) 底物与AAR的作用细节。（3）AARNADPH-ADO的结构代表了AAR催化产生醛的状态
在AAR的催化过程中，其脂酰-酶的中间状态会结合NADPH，并在其作用下断裂硫脂键，释放脂肪醛。通过将AARthioester-ADO的晶体浸泡NADPH，研究人员获得了AARNADPH-ADO的结构。结构清晰的展示了NADPH和硬脂酰基的位置（图4a）以及参与NADPH结合的AAR的氨基酸残基（图4b）。NADPH结合在C294上方的裂口处，此处形成一个亲水通道，主要由Mid结构域构成，该通道和脂酰链所占据的疏水通道相连。AAR催化反应需要利用NADPH，但是不能利用与NADPH极为相似的NADH，通过结构分析，研究人员发现NADPH的磷酸基团被AAR中三个保守的碱性赖氨酸残基包裹，NADPH相比于NADH多了这个磷酸基团，由此可以推测AAR利用这3个保守的赖氨酸来选择NADPH。NADPH的烟酰胺C4和脂酰链的第一个碳原子之间的距离仅为3.14Å,这个距离满足催化产生醛的需要，表明这个结构代表了AAR处于催化作用发生的状态。▲图4 (a) AAR结合NADPH和脂酰链的结构；(b) NADPH与脂酰链及AAR的作用细节。（4）AARstearoyl-CoA-ADO的结构代表了AAR释放产物醛的状态
为了得到AAR结合完整底物Stearoyl-CoA的结构，研究人员将AAR的294位半胱氨酸突变为丝氨酸，并将这种突变体与Stearoyl-CoA孵育，最终得到了AARstearoyl-CoA-ADO结构。结构中Stearoyl-CoA稳定结合在AAR内部通道中（图5a）。并且由于C294被突变为丝氨酸，该突变体不能与底物Stearoyl-CoA形成共价的硫脂键，该特征导致在AARstearoyl-CoA-ADO结构中，Stearoyl-CoA的结构更为舒展，其第一位的C原子离开S294约6埃，从而使得脂酰链整体向通道的远端，即AAR-ADO的作用界面方向移动。同时，在AAR表面的通道出口扩大，表明该结构代表了AAR催化脂肪醛生成后，释放脂肪醛的状态。同时，通过AARstearoyl-CoA-ADO结构和AARNADPH-ADO结构的叠合比较，发现NADPH和CoA头部有完美的叠合。这个结果为以前报道的AAR以“乒乓机制”结合底物和NADPH提供了坚实的结构依据[2, 3]。通过本项研究，并结合之前已报道的结果[4]，研究人员发现，当AAR-ADO复合物形成后，两个蛋白内部形成了一个连续贯通的疏水通道（图5b），该通道很可能是疏水的长链脂肪醛从AAR传递到ADO的通道。▲图5 (a) AARSTEAROYL-CoA-ADO的晶体结构切面图，展示AAR内部的底物通道；(b) AAR和ADO之间的连续疏水通道。通过该项工作，研究人员揭示了蓝藻AAR结合底物和辅因子的结构细节，阐明了其采取“乒乓机制”在同一位点结合底物和辅因子的结构基础，揭示了AAR-ADO复合物的相互作用方式和关键氨基酸残基，并发现AAR-ADO复合物中形成了一个贯穿两个蛋白的疏水通道。基于该项工作，并结合课题组前期的研究结果（Pro Cell, 2015），研究人员提出了蓝藻烷烃生物合成途径的模型（图6），模型中的S0,S2,S3,S4状态分别对应AARapo，AARthioester-ADO，AARNADPH-ADO和AARstearoyl-CoA-ADO结构，该模型解释了疏水的脂肪醛分子是如何在两个水溶蛋白之间进行传递的问题，同时大胆猜想了AAR和ADO在烷烃合成过程中相对独立又互相协作的工作机制。这是研究人员首次从结构生物学角度揭示了蓝藻脂肪烃生物合成途径的催化过程和调控机理，为继续改造优化该途径提供了重要基础。
▲图6 蓝藻中AAR和ADO催化的脂肪烃生物合成途径模型。1.Jia C, Li M, Li J, Zhang J, Zhang H, Cao P, Pan X, Lu X, Chang W. Structural insights into the catalytic mechanism of aldehyde-deformylating oxygenases. Protein & cell 2015, 6(1): 55-67.
2.Warui DM, Pandelia ME, Rajakovich LJ, Krebs C, Bollinger JM, Jr., Booker SJ. Efficient delivery of long-chain fatty aldehydes from the Nostoc punctiforme acyl-acyl carrier protein reductase to its cognate aldehyde-deformylating oxygenase. Biochemistry 2015, 54(4): 1006-1015.3.Lin F, Das D, Lin XN, Marsh EN. Aldehyde-forming fatty acyl-CoA reductase from cyanobacteria: expression, purification and characterization of the recombinant enzyme. The FEBS journal 2013, 280(19): 4773-4781.4.Buer BC, Paul B, Das D, Stuckey JA, Marsh EN. Insights into substrate and metal binding from the crystal structure of cyanobacterial aldehyde deformylating oxygenase with substrate bound. ACS chemical biology 2014, 9(11): 2584-2593.http://www.ibp.cas.cn/ktzz/ktzz_L/201902/t20190228_5246323.html
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