摘  要   对高中生物中常见且易混淆的3组试剂：如酚红与酚酞，二苯胺和甲基绿，碱性染料进行分析，为生物学实验教学提供参考。

关键词   酚红 酚酞  甲基绿  碱性染料

1．酚红与酚酞是同一种物质吗

人教版高中《生物·选修1·生物技术实践》中“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”中利用酚红作为指示剂，初步鉴定尿素分解菌。那么同为酸碱指示剂的“酚酞”与“酚红”仅一字之差，是不是同一种物质，能不能只用酚酞作为指示剂呢？

酚红又名苯酚红、苯酚磺酞，其分子式为C₁₉H₁₄O₅S，分子结构如图1所示。酚酞分子式为C₂₀H₁₄O₄，分子结构如图2所示。

图1  酚红结构式                             图2  酚酞结构式

由此可知，酚红和酚酞结构非常相似，但不是同一物质。它们的物理化学性质也不一样。酚红是一种深红色结晶性粉末，1 g可溶于1300 mL水，几乎不溶于醚和氯仿，是微生物培养中常用的指示剂。酚红指示剂变色范围是：pH 6.8~8.4呈现橙色；pH小于6.8呈现黄色；pH值高于8.4时呈现红色。酚酞是白色或微带黄色的结晶粉末，难溶于水而易溶于酒精，因此通常把酚酞配制成酒精溶液使用。酚酞试剂在酸性和中性溶液中为无色；pH 8.2~10.0，颜色由无色至红色。

上述实验“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”，能不能只用酚酞作为指示剂呢？为了解答这一问题，笔者用酚红与酚酞两种指示剂做了对比实验。该实验采用人教版选修1培养基配方，该配方每1000mL培养基添加10 g葡萄糖和1 g尿素。A组1000 mL培养基加入0.5 g酚红，B组1000 mL培养基加入0.5 g酚酞。结果发现，A组酚红溶解，培养基呈橙色；B组酚酞不溶解，培养基呈无色。培养至第4~5 d，A组部分菌落周围出现红色环带， B组菌落周围没有红色环带。

土壤中的尿素分解菌产生的脲酶将尿素分解形成NH₃和CO₂ 导致培养基碱性增强，pH升高；同时，培养基中还加入了较多的葡萄糖作为微生物的碳源，葡萄糖被分解产生较多的CO₂ ，过量的CO₂ 和NH₃生成弱碱性的NH₄HCO₃ 。按照人教版培养基配方，生成的NH₄HCO₃的浓度较低，结合NH₄HCO₃ 的电离平衡常数可计算得知培养基pH不超过7.8，该pH不在酚酞的变色范围之内，但处于酚红的变色范围之中，可以使得橙色的酚红变为红色。再者酚酞需溶解在酒精中，不溶于水，不可能使用酒精配制培养基。综上所述，“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中不能使用酚酞代替酚红。

2．碱性染料呈碱性吗

人教版高中生物必修1教材多处提及碱性染料。“染色质是及细的丝状物，因容易被碱性染料染成深色而得名。”“染色体容易被碱性染料（如龙胆紫溶液）着色”，那么碱性染料呈碱性吗？

作为染料必须具备两个条件：一是具有颜色；二是与被染组织有亲和力，即染料必须具有发色基团与助色基团^[1]。其中发色基团能使染料显示颜色，而助色基团则使染料与被染组织间产生亲和力，它们共同决定了染料的染色性质。酸性或碱性染料的界定并非由染料溶液的pH决定的，而是由染料中的助色基团在水中电离后所带的电荷决定^[2]，一般来说助色基团带正电荷的染料为碱性染料，反之则为酸性染料。龙胆紫、洋红、品红等碱性染料在配制过程中使用了醋酸或者盐酸，所以，这些染料染液pH都小于7。

龙胆紫、洋红、品红等碱性染料的助色基团在酸性环境中能与H^＋结合带上正电荷，从而与相应物质或结构进行极性结合，进而染色。“观察根尖分生组织细胞的有丝分裂”实验中使用盐酸后，如果不漂洗直接染色，将染色失败。盐酸是强酸，电离出来的H^＋ 可与细胞核和染色体等结构结合带正电，而碱性染料的助色基团同样带正电荷，同性电荷排斥，因而不能染色，而非因酸碱中和而不能染色^[3]。

3．DNA粗提取与鉴定实验能用甲基绿代替吗

“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验中，甲基绿、吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。“DNA粗提取与鉴定” 实验，DNA与二苯胺试剂加热可以产生蓝色化合物。那么“DNA粗提取与鉴定”实验能否用甲基绿代替二苯胺呢？

DNA与二苯胺发生反应必须在酸性条件下才能生成蓝色物质。在酸性条件下加热，DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色。在DNA鉴定实验中，需将提取出的DNA溶解于0.015 mol/ L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后无色的二苯胺试剂变成蓝色。溶液蓝色的深浅与DNA的含量有关，DNA含量越多，颜色越深。。

理清了颜色变化的原理，那么很显然“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验中不能用二苯胺试剂代替甲基绿。DNA的鉴定实验又能否用甲基绿呢？不同于二苯胺溶液的无色，甲基绿试剂多为淡绿色，与DNA的亲和力较强，结合呈蓝绿色。如果直接将甲基绿试剂加入溶解了DNA的试管中，那么整支试管都会呈现绿色，即使DNA被染色，这“万绿丛中一点绿”也是观察不出来的。所以，DNA的鉴定实验不能用甲基绿试剂代替二苯胺。

参考文献

［1］       陈纯宜．碱性染料的着色原理[J]．中学生物教学，2013（1~2）：71.

［2］       张丽．碱性染料[J]．生物学教学，2011，36（5）：64

［3］       申定健．染色体和细胞核染色常用的三种碱性染料[J]．生物学教学，2017，42（09）：61.