利用酰亚胺基氟磺酰胺通过六价硫氟交换进行“逆向”药物发现

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这里和大家分享的是最近发表于Nature Chemistry上的一篇关于二代点击化学：六价硫氟交换反应（SuFEx）的一个最新的应用工作。该工作由Scripps Research的几个著名课题组合作完成，其中化学方面的工作由K.Barry Sharpless课题组完成，而生物方面的工作主要由Jeffery W.Kelly课题组完成。李苏华教授（现中山大学）完成了该系列硫氟类小分子探针的合成。




与通过候选药物分子和蛋白质可逆地结合来调节生物功能的常规方式相比，通过候选药物分子与其靶蛋白形成共价链接的调节方式尚未得到充分研究，部分原因是人们对脱靶反应性的担忧。然而，在结合特定蛋白质时才被活化生成共价键的潜在亲电试剂可以最小化与脱靶反应性相关的毒性。在此，我们研究了一类可进行六价硫氟交换的弱亲电试剂—酰亚胺基氟磺酰胺（SAF,sulfuramidimidoyl fluoride），结构通式如下：


研究表明，SAF与蛋白质的结合可允许特定氨基酸侧链对其亲核进攻生成链接物。我们将带有亲电性SAF官能团的小分子与人类细胞裂解液一起孵育，并通过亲和色谱—质谱法确认了形成的蛋白质链接物。这种逆向药物发现方法识别出一种能与活细胞中重要的抗癌靶点—聚（ADP核糖）聚合酶1（PARP1,poly(ADP-ribose) polymerase 1）共价结合并不可逆地抑制其活性的化合物。
 
在常规的药物发现方法中，人们已筛选出了许多具有调控分离的靶蛋白或特定细胞表型功能能力的小分子。这些方法可以筛选得到历经共价和非共价机制而发挥作用的活性化合物。出于避免脱靶毒性的考虑，历史上制药界一直避免使用与靶点形成共价结合的药物。与非共价抑制剂相比，共价抑制剂在延长作用时间，降低剂量要求以及降低耐药发展可能性方面具有潜在的优势。因此，我们发展了一种逆向药物发现（IDD，inversedrug discovery）策略，该策略涉及使多种含有较弱但可激活的亲电试剂与细胞裂解液中的人类蛋白质组反应，以识别目标蛋白质。该方法仅使用少量的具有温和反应性的化合物即可识别人蛋白质组中的许多亲核位点。
较早的IDD研究使用的是芳基氟磺酸酯，其被互补蛋白结合位点的几何结构和组成活化生成共价键，得到酶和非酶链接物。从本研究中我们了解到，合适的蛋白质结合位点的存在使亲电硫中心置于酪氨酸或赖氨酸侧链亲核试剂的近端，从而使六价硫氟交换（SuFEx,sulfur(VI) fluoride exchange）反应得以进行。附近存在的阳离子精氨酸和/或赖氨酸侧链似乎对于降低SuFEx反应的势垒至关重要，因为这些残基可能促进了反应过程产生的氟离子的离去。这些阳离子残基也可能干扰具有反应性侧链的pKa，从而增强其亲核性。采用磺酰氟和芳基氟磺酸酯的SuFEx反应的潜力已在材料科学和后期药物分子功能化以增强药理活性等领域得到证实。
在此，我们将IDD方法应用于SuFEx衍生的亲电试剂的另一个家族，即酰亚胺基氟磺酰胺（SAF），其蛋白质组反应性先前未经评估。我们探讨了以下假设：蛋白质中独特的化学环境应允许使用反应性较低的，通过SuFEx衍生的SAF用于IDD。SAF是通过两步SuFEx反应过程制备的（图1a）。首先，烷基或芳基伯胺与四氟氧硫（SOF4）在标准温度和压力及两当量的有机碱存在下反应，生成相应的酰亚胺基二氟氧硫。接着，在三乙胺的存在下，用仲胺取代剩余的其中一个氟，即可生成相应的SAF（图1a）。与芳基氟磺酸酯相比，SAF的亲电性降低可能是由于用S=NR键取代了S=O键，从而增加了SAF中硫中心周围的电子密度，使氟与硫之间具有更强的键能。尽管SAF和芳基氟磺酸酯中的硫中心均为四面体构型，但在SAF类型分子中该六价硫中心是手性的。
在这项研究中，我们通过亲和色谱—质谱联用将与SAF反应的人类蛋白质进行了匹配，然后使用重组蛋白在体外验证所选的链接反应。我们证明了不同结构的SAF可与不同组的人类蛋白质反应。最后，我们将基于胸苷分子改造的SAF与聚（ADP核糖）聚合酶1（PARP1）进行了匹配，并证明了其在体外和在活细胞中对PARP1的共价抑制，该策略可能是用于治疗癌症的非共价PARP1抑制剂的有效补充。


图1 SAF 1–16与HEK293T细胞裂解液中的蛋白质反应。a，用于合成含SAF的化合物的方案。伯胺与SOF4反应形成酰亚胺基二氟氧硫，该中间体与仲胺反应生成SAF。b，本研究中使用的SAF化合物1–16的结构。c，上图：在加入TMR-N3进行CuAAC反应后，对SAF化合物（50μm）孵育（18h）的HEK293T裂解液进行SDS-PAGE/罗丹明分析（详细条件请参见方法）。每个SAF都与一组不同的蛋白质反应，正如每个泳道中不同的条带模式所示。下图：SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色表明每个泳道中蛋白质负载均等。每个条带的荧光强度的差异是由不同SAF对蛋白质的反应产物而不是经过处理的HEK293T裂解物之间蛋白质丰度的差异所致。该实验进行了两次，结果相似。r.t.，室温。
 
结果：
SAF与人类蛋白质反应。我们着手考察人类蛋白质组与16种结构不同的含SAF化合物的反应性（图1b）。SAF化合物1-16中大部分的结构未经报道，其中含有在本研究开始时可用的端炔结构。尽管我们希望使SAF结构多样性最大化，但我们没有选择与特定蛋白质家族结合的基序。我们发现给定的SAF与目标蛋白之间的反应进度在24小时内线性增加。因此，我们选择18小时作为孵育时间，将每个SAF分别与HEK293T细胞裂解液孵育，以捕获足够数量的SAF链接蛋白，并将这16个链接反应与荧光试剂四甲基罗丹明叠氮化物（TMR-N3）进行一价铜催化的叠氮—端炔环加成（CuAAC）反应，并在变性凝胶（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离链接物后，用荧光显像（图1c）。值得注意的是，通过SDS-PAGE可检测到化合物1-16对的人类蛋白质组显示出不同的反应性，这表明这些化合物不同结构对于不同蛋白质的亲和力是链接过程选择性的关键决定因素。为了更全面地考察形成的链接物并检测低丰度的链接物，我们使用了定量液相色谱—串联质谱（LC-MS/ MS）。


 


图2 |使用等量异位MS/ MS标签结合蛋白质组质谱技术鉴定SAF1–16靶向的蛋白质。a，TMTLC-MS / MS工作流程。将HEK293T裂解物用特定探针（50μM）处理18h后，（1）与生物素叠氮化物进行CuAAC反应。（2）使用链霉亲和素树脂富集蛋白质—探针链接物，然后将结合的蛋白用Na2S2O4从树脂上洗脱。（3）用胰蛋白酶降解富集的链接物。（4）用相应的TMT试剂标记所得的肽段。（5）收集标记的肽段并基于多维蛋白质鉴定技术进行LC-MS/ MS分析，与DMSO对照相比可进行蛋白质识别和定量分析；b，通过定量LC-MS/ MS显示所选蛋白质探针SAF1–16的富集率热图。所示蛋白的富集率＞1.5（相对DMSO）P值＜0.25（通过双尾无配对t检验计算）。灰色方块表示无法达到该标准。数据通过两次重复实验得出（n=2）。有关精确的富集率和P值，请参见SI。
 
蛋白质组学确定了SAF1–16的靶蛋白。为了确定SAF 1–16靶向的人类蛋白质，我们对16种蛋白质组标记反应（在25°C下孵育18小时）进行了可被还原裂解的生物素叠氮化物（biotin-N3）的CuAAC反应，随后通过链霉亲和素亲和色谱富集SAF链接的蛋白质。使用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）从链霉亲和素树脂中洗脱结合的蛋白质后，用胰蛋白酶降解并进行串联质谱标签（TMT，tandem-masstag）标记。通过LC–MS/ MS，以用二甲基亚砜（DMSO）处理过的蛋白质组细胞裂解物样品（作为媒介，但经过其他相同处理）为基准，对SAF—蛋白质链接物进行定量分析（图2a）。我们将某种蛋白质的富集率定义为用SAF处理后样品中给定蛋白质与用媒介物处理后样品中相同蛋白质的TMT所记录的离子强度的平均值的比值，并根据富集率对蛋白质进行排序。用富集率和统计学意义比较两种处理条件（SAF处理与DMSO处理）下的重复测量值，以评估每种蛋白质靶点确定的可靠性。我们对蛋白质“具有活性”（较强的富集度（富集率>1.5），且两次测量具有合理的统计学一致性（P值<0.25））程度进行了排序。此外，我们注意到几种蛋白质与不同SAF大量富集，这进一步表明这些蛋白质对SAF具有反应性。
正如在基于SDS-PAGE分析的比较中观察到的（图1c），对SAF1-16与人细胞裂解液（HEK293T）反应的LC-MS/ MS分析表明，由不同分子结构的SAF形成的蛋白质链接物组之间存在显著差异（图2b展示对SAF具有反应性的蛋白质样品）。SAF似乎可以靶向具有多种功能的蛋白质，包括酶和非酶。结构蛋白和结合RNA的蛋白只是SAF1-16富集的分子功能中的几个（相对DMSO富集率>1.5，P值<0.25）。在已被识别出的蛋白质中有GSTP1，NME1和CRABP2，它们都被证实与芳基氟磺酸酯官能团分子具有反应性。值得注意的是，我们发现了一些以前没有被芳基氟磺酸酯靶向的，但是在治疗方面十分重要的蛋白大量富集。其中包括：PARP1和PARP2，它们是参与DNA损伤修复途径的关键蛋白，也是BRCA突变相关的乳腺癌和卵巢癌的有效治疗靶标；巨噬细胞迁移抑制因子（MIF，macrophagemigration inhibitory factor），它可增强某些癌症的转移潜能并在慢性和急性炎症性疾病中充当促炎信号；可溶性环氧化物水解酶（EPHX2，solubleepoxide hydrolase），其作为某些心血管疾病的治疗靶标在药理学领域已引起广泛关注；支链氨基酸转氨酶1（BCAT1，branchedchain amino acid transaminase 1），它是骨髓性白血病、恶性上皮肿瘤，成胶质细胞瘤和某些乳腺癌的治疗靶标。尽管我们观察到了其他SuFEx衍生的亲电试剂靶向的137种蛋白质的富集，但SAF1–16识别出的491种蛋白质中有72％以上与芳基氟磺酸酯或磺酰氟类探针所识别的蛋白质不同。
 

 
图3 |验证SAF与所选重组蛋白之间的反应。a，所选SAF（30µm）和蛋白质（3µM）之间反应（24h）的荧光分析。标准曲线包含四组三倍稀释的荧光标记MIF溶液（3.00–0.037µM），该凝胶板代表三个独立的实验（n=3）。b，a中荧光带的定量图。误差棒代表三个独立实验（n=3）的平均数抽样误差。P值采用双尾未配对t检验计算。**P≤0.01，***P≤0.001；准确的P值已在图中标明。c，MIF与BITC链接的X射线晶体结构，Tyr96&apos;来自相邻单体（PDBID 3WNT）。d，EPHX2与TPPU链接的X射线晶体结构（PDBID 4OD0）。e，结合到olaparib的PARP1cat域的X射线晶体结构（PDBID 5DS3）。黄色高亮的残基表示通过LC-MS / MS识别出的对SAF具有反应性的亲核位点。其他标记部分表示其他可能的结合位点和/或可能与SAF（c-e）反应很重要的残基。f，在含或不含BITC（50μm）的情况下，MIF（5μm）和SAF13（50μm）反应（24h）的荧光分析，该实验进行了一次（n=1）。g，在含或不含TPPU（10μm）的情况下，EPHX2（3μm）和SAF9（50μm）反应（24h）的荧光分析，该实验进行了一次（n=1）。h，在含或不含olaparib（10μm）的情况下，PARP1cat（3μm）与SAF2（100μm）反应（24h）的荧光分析，该实验进行了一次（n=1）。
 
验证SAF与所选蛋白的反应。为了验证通过亲和色谱-MS/ MS鉴定出的对SAF具有反应性的蛋白，我们表达并纯化了四种有重要治疗意义的蛋白，并使每种纯化的蛋白与具有高富集率（“阳性”活性化合物）或低/无富集率（“阴性”活性化合物）的SAF分别反应。对于PARP1，我们仅表达了催化结构域（PARP1cat）。筛选出化合物13、11、9和2分别作为MIF，BCAT1，EPHX2和PARP1cat的阳性活性化合物，并同时筛选出化合物10、1、15和11分别作为相同蛋白质的阴性活性化合物。经过18小时的反应后，每种蛋白质（3μM）与TMR-N3进行CuAAC反应，并通过SDS-PAGE分离链接物，其结果用荧光可视化（图3a）。在所有四种情况下，阳性活性化合物比阴性活性化合物与其各自对应的蛋白质反应性更强，并且具有统计学意义（图3b）。这表明BCAT1和EPHX2都不与其SAF探针有特异性反应。这可通过重组蛋白中关键的翻译后修饰的丧失和/或与单独的缓冲液相比其在裂解物中经历的不同条件来解释。已知EPHX2和BCAT1都对其介质的氧化还原电位敏感，这可能会诱导其构象变化，从而影响与SAF的结合和/或反应性。根据LC-电喷雾电离（ESI）MS的测定，发现25°C下16小时后，化合物17（未包含在我们的16种化合物的库中）与MIF发生定量和化学计量反应。因此，在每个变性凝胶上均包括一条标准曲线，该曲线包含完全结合到17和四甲基罗丹明的重组MIF从3µM至37nM的三倍递减的系列稀释液中，以量化每个反应的进度（图3）。
 

 
图4 |分析SAF子集的PARP1抑制活性。a，用于PARP1自动修饰assay的SAF18-23的结构。左图：18-22的结构，它们都具有共同的胸苷核结构，但所链接的2°胺之间存在差异。右图：化合物23的结构。所有上述化合物均未通过用于识别SAF反应蛋白的IDD工作流程（图2a）。b，PARP1体外活性assay的SDS-PAGE分析。将PARP1与所示化合物孵育20分钟（顶部）或18h（底部）后，加入NAD+（100μm）。在分析之前，将自修饰反应在室温下进行1小时。c，b中的SDS-PAGE定量分析。误差棒代表代表三个独立实验（n=3）的平均数抽样误差。使用双尾配对t检验确定P值。与用DMSO处理的样品相比，*P≤0.05，**P≤0.01（有关分析和精确的P值，请参见源数据）。53.5％处的虚线表示体外未修饰的PARP1的近似基线（在20分钟和18h的媒介物处理之间的平均值）。d，左图：在PARP1cat的NAD+结合位点结合的Rucaparib的X射线晶体结构（PDBID 4RV6）。Tyr907（SAF反应残基）用黄色高亮显示，近端Tyr889用绿色高亮显示，Rucaparib用粉色高亮显示。右图：FDA批准的PARP1抑制剂Rucaparib的结构。e，PARP1cat（3µm）和所选SAF探针（30µm）之间反应的凝胶内荧光分析。加入olaparib（30μm）作为对照，以消除PARP1cat的NAD+结合位点内的反应。在进行CuAAC反应之前，将PARP1cat与所示化合物孵育20分钟（顶部）或18小时（底部）。f，e中凝胶内的荧光定量分析。误差棒代表三个独立实验（n= 3）的平均数抽样误差。为了清楚起见，省略了包含olaparib的反应结果。
 

 
图5 | SAF 2不可逆地抑制HeLa细胞中PARP1的活性。a，用SAF处理过的HeLa细胞中PARylation的免疫印迹（IB）分析。将细胞与浓度递增的olaparib、SAF2或5孵育24h后，加入10mMH2O2。用靶向PAR（上）或PARP1（中）的抗体分析印迹。PAR和PAR修饰的PARP1的减少（即中间部分较高的分子量涂片）表明PARP1酶活性受到抑制。该实验进行了一次（n=1）。b，用SAF2（100μm）或olaparib（0.1-10μm）处理HeLa细胞24h，然后用PBS（pH7.4）洗涤细胞两次去除上述化合物后对聚（ADP—核糖）化程度进行的Western印迹分析。用靶向PAR（上）或PARP1（中）的抗体分析印迹。用2处理并洗涤的细胞中PAR和PAR修饰的PARP1的减少均表明2不可逆地抑制PARP1。该实验进行了一次（n=1）。GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
 
三个靶蛋白上的SAF反应位点。为了进一步了解SAF的链接位点，我们在已知的活性位点抑制剂存在下，将三种纯化的蛋白质与SAF反应（图3），随后将它们在体外与TMR-N3进行CuAAC反应后通过SDS-PAGE确认链接情况。将已知能与MIF的N端脯氨酸残基（Pro1）成键（图3c）的异硫氰酸苄酯（BITC;50μM）加入到重组MIF（5μM）和13（50μM）的反应体系后强烈抑制了链接物的生成（图3f），这表明SAF探针13与Pro1或附近的残基反应。对MIF·13链接物的LC-MS/ MS分析进一步证实了这一结果。类似地，将已知的EPHX2非共价抑制剂1-三氟甲氧基苯基-3-（4-（1-丙酰基哌啶基））尿素（TPPU;10μM）（图3d）加入到重组EPHX2（3μM）与9（50μM）的反应体系后，荧光信号大大削弱（图3g），这表明9占据了酶的活性位点。该位点包含两个酪氨酸残基Tyr383和Tyr466，它们可水解某些脂肪族环氧化物。这两个催化残基中的任何一个都可能是SAF和EPHX2之间可能的反应位点，因为它们都易被硝化。通过对EPHX2·9链接物的LC-MS/ MS分析表明Tyr466为EPHX2中的活性残基。值得注意的是，9的结构中同时包含芳基氟磺酸酯部分；但9和EPHX2之间的反应发生在SAF亲电中心，因为该蛋白质被其他不含芳基氟磺酸酯的SAF（1和12）所富集。为支持该反应发生在SAF的硫中心而不是芳基氟磺酸酯的硫中心的假设，我们使EPHX2与另一种化合物9*反应，该化合物与9具有相似的结构，但不含芳基氟磺酸酯。LC-MS/ MS证实EPHX2和9*之间的反应发生在Tyr466残基，与9反应的残基相同。在PARP1非共价抑制剂olaparib（图3e）存在下，PARP1cat和2之间的标记反应并未生成共价链接物（图3h），这表明2参与修饰烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）结合位点中的PARP1。通过对2与PARP1cat的反应进行LC-MS/ MS分析，我们确定2在该位点与Tyr907反应形成PARP1·2链接物。此外，2和PARP1cat的Y907F突变体（与野生型PARP1cat相比）之间的反应被强烈抑制，进一步证实了上述结论。尽管我们不能排除竞争的变构机制，但先前报道的BITC，TPPU配体和olaparib似乎分别与MIF，EPHX2和PARP1cat中的SAF反应性残基的近端结合。
 
SAF在体外抑制PARP1活性。PARP1响应单链DNA断裂并执行关键信号翻译后修饰。它利用NAD+介导ADP—核糖在自身和其他靶蛋白上的聚合。新合成的聚（ADP—核糖）（PAR）链充当了将各种蛋白质家族汇集到DNA损伤部位的信号。考虑到PARP1是已被验证的药理学靶点，我们试图确认该酶与SAF探针的反应会抑制其酶活性。我们在选定的SAF存在下测试了PARP1的活性，除23外，所有SAF都含有炔丙基胸苷结构（图4a）。在加入NAD+之前，用活化的受损DNA和SAF对PARP1进行预孵育20分钟后，除23表现出对PARP1明显的抑制作用（图4b）外，其余SAF对PARP1活性未见明显抑制。然而，在反应18小时后，2和5也观察到对PARP1明显的抑制作用（图4b，c）。23与另一种FDA批准的PARP1抑制剂rucaparib具有相似的结构。在检验与rucaparib结合的PARP1cat的共晶体结构（图4d，蛋白质数据库（PDB）ID4RV6）后，我们认为，23的抑制作用主要是通过与PARP1的非共价相互作用介导的。为了证明这一假设，我们将2、5、20和23与PARP1cat反应20分钟或18h，然后与TMR-N3进行CuAAC反应后，通过荧光SDS-PAGE对结果进行定量分析（图4e，f）。很明显，23并未与PARP1cat反应。我们假设23在PARP1cat的NAD+结合位点采用接近rucaparib的结合方向，这阻止了SAF与Tyr907结合。但是，SAF2和5在25°C仅20分钟后即可与PARP1cat反应。这些结果表明，用SAF亲电试剂简单地修饰已知蛋白质配体的现有结构通常不会导致链接反应，这强调了SAF位于合适位点的重要性。
 
SAF2抑制HeLa细胞中的PAR合成。为了验证SAF是否抑制活细胞中的PARP1活性，我们用2、5或olaparib处理HeLa细胞24h后，加入H2O2处理15分钟以诱导聚（ADP—核糖）化，在此期间未观察到细胞死亡。细胞裂解后，使用识别PAR和PARP1的抗体通过免疫印迹衡量PAR修饰程度。用2处理的细胞在一般的聚（ADP—核糖）化和PARP1自修饰中均表现出显著的活性降低，这与用5单独使用媒介处理的细胞结果不同（图5a）。正如预期的是，用olaparib处理（阳性对照）将导致PAR合成完全抑制。同时注意到2也具有一定抑制细胞中PARP1活性的能力，但其的结构尚未通过药物化学方法针对细胞通透性或PARP1结合性进行优化。为了研究细胞活性，我们对HeLa细胞用olaparib或2处理24小时后，洗涤细胞并加入新鲜媒介（不含抑制剂），再孵育6小时。再加入H2O2诱导PARP1活性。结果显示出2保留了其大部分对PARP1抑制活性，而olaparib的活性则大大降低了（图5b），这表明2的不可逆链接抑制了PAR的合成，直到该酶被细胞重新合成。
 
讨论：
总体而言，在过去的药物发现过程中，人们并未积极主动地利用能够与蛋白质发生不可逆反应的官能团，这可能是对脱靶反应性及其引发的相关毒性的担忧。然而，最近出现了能表现出高度减弱的亲电反应性，但仍然具有与蛋白质潜在的反应性的新官能团，例如那些能够进行SuFEx的官能团，这暗示着有意利用这些功能的药物发现工作可能会得到高度选择性的共价药物。我们之前使用芳基氟磺酸酯的IDD方法发现了针对11种人类蛋白质的经过验证的共价探针。在本研究中，一组与病理密切相关的新蛋白质（例如BCAT1，EPHX2，PARP1和MIF）通过IDD策略与SAF相匹配。重组BCAT1和EPHX2对它们相应的SAF探针显示出低反应性，这表明需要大量的药化工作来调节SAF的功能。相反，MIF和PARP1和我们第一代化合物库中SAF的反应性很强，这表明发现对这些蛋白质更具反应性和选择性的SAF化合物可能需要更少的工作。值得注意的是，我们证明了2即使在被洗脱后也抑制了活癌细胞中的PARP1，这表明基于SAF的PARP1不可逆抑制可能是一类可行的抗癌策略。
DNA系统中用于损伤响应和修复的获得性或遗传性缺陷会增加终生患癌的风险。两种DNA修复蛋白BRCA1和BRCA2中的突变是与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的首批突变。对PARP1靶点的研究是有吸引力的，因为1980年的研究表明抑制PARP1使白血病癌细胞会对细胞毒性烷基化试剂敏感。这一前提是建立在大量的前期临床证据基础之上的，这些证据支持PARP抑制剂能够敏化和增强放疗和细胞毒性化疗的效果。然而，研究发现BRCA突变细胞对PARP抑制剂的敏感性提高了1000倍这一关键性突破，使得在肿瘤学中对合成致死性进行临床验证成为可能，这一概念最早于1922年提出，其中同时靶向两个基因或蛋白可能具有致死性，即使每个基因或蛋白的单独缺失和/或抑制对其自身没有太大影响。
使用现有的PARP1抑制剂治疗癌症的机制与高毒性（例如中性粒细胞减少和贫血）有关。基于共价作用机理的新型PARP1抑制剂有可能避免与现有抑制剂相关的副作用。最近有报道称，PAR的合成均能促进α-突触核蛋白在体外和体内的聚集，这突出了抑制PARP1作为治疗帕金森的潜在疗法的重要性。这种疗法很可能需要延长作用时间，这正是基于SAF的PARP1抑制剂的特点。值得注意的是，我们的PARP1活性化合物与FDA批准的抑制剂（例如olaparib）几乎没有结构相似性。我们的化合物代表了抑制剂设计和合成的新起点。对共价PARP1抑制剂的优化可能会实现对PARP1或PARP2的选择性抑制，而非共价抑制剂则有望与更广泛的PARP家族成员结合。
SAF表现出的低反应性意味着仅有一部分人蛋白质组能够与该官能团反应，这大大降低了相对于反应性更高的亲电试剂所观察到的脱靶反应性。我们利用此特点与它们的手性和简单的合成方法相结合，可以非常适合快速建立SAF化合物库，因此有可能简化基于药物化学对已发现的活性化合物的优化方法。对于涉及芳基氟磺酸酯的IDD，则必须通过单独的反应或明智地使用一锅法，将亲电性基团和亲和链接位点置于不同位置，导致芳基氟磺酸酯在化合物库构建中的应用更具挑战性。基于上述原因，我们建议未来的IDD过程认真考虑SAF的潜力。
 


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