第一作者：Xiang Ran，Zhenzhen Wang

通讯作者：Fang Pu，Jinsong Ren，Xiaogang Qu

通讯单位：长春应用化学研究所，安徽医科大学

研究内容：

活体和体内端粒酶活性的目视监测对临床诊断和治疗具有重要意义。然而，由于探针进入细胞的困难和复杂生物环境的干扰，大多数检测方法都是在体外进行的。在此作者首次开发了一种基于Au纳米簇(Au NCs)的新型探针，该探针具有核酸驱动聚集诱导发射(AIE)特性。该探针用于端粒酶的检测，灵敏度高。重要的是，该探针可以在活细胞和活体实体肿瘤组织中实现端粒酶成像。该研究为AIE的生成提供了一种特殊的金属纳米团簇连接方式。开发具有AIE活性的金属纳米团簇作为在体内和体外疾病检测的诊断工具具有巨大的潜力。

要点一：

探针的设计原理如图1所示，探针由A链修饰的Au NCs，一个端粒酶底物寡核苷酸和B链修饰的Au NCs组成。含有发夹结构的A链通过3’末端标记的硫醇在Au NCs表面进行修饰端粒酶底物寡核苷酸(TS引物)在茎段与A链杂交。在端粒酶存在的情况下TS引物可以从3’端延伸，产生重复序列。这个重复的序列可以与A链的相应区域杂交，导致发夹结构的打开。与TS引物端粒酶触发的延伸产物进行链杂交后，A链5’端释放一个支点结构域，与修饰在Au NCs上的B链杂交，导致Au NCs聚集。

要点二：

TEM图像显示，Au NCs自组装形成平均尺寸为65 nm的大颗粒。通过紫外熔融分析确定了核酸序列的热力学稳定性。实验使用的是含有端粒重复序列的延伸TS引物，即端粒酶反应产物(TRP)。图2d的熔化剖面可以看出，发夹结构和混合结构的A链的熔化温度(T m)值A链TRP及相应结构域分别为56.9℃和62℃。后者高于前者，说明由于杂交长度较长，杂种比发夹结构更稳定。为了进一步证明杂化和置换采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对DNA进行分析，如图所示，A链与TRP的复合物呈现低迁移率的凝胶带，说明A链的发夹结构被TRP打开并与TRP杂交，将B链加入到A链和TRP的杂合体中迁移率进一步降低。

要点三：

探针用于原位跟踪细胞内端粒酶活性。HeLa细胞在20mm共焦培养皿中培养24 h后，将25 mL探针加入细胞中。之后进行荧光成像。如图3a和b所示，在前20分钟内观察到的荧光可以忽略不计。从第30分钟开始，细胞质中可见红色荧光。随着培养时间的延长，发射强度逐渐增大，这是端粒酶触发TS引物延伸所致。在120 min时，荧光达到最大值。为了证实A链发夹结构的开放是由端粒酶延长TS引物在活细胞中特异性触发的，作者制备了不带TS引物的A链修饰Au NCs，并用于细胞内成像。如图3c所示，在没有TS引物的情况下，用A链修饰的Au NCs孵育120 min后，细胞荧光可以忽略不计。

要点四：

基于该探针在活癌细胞中监测和成像端粒酶活性的行为，作者使用该探针在活动物模型中直接可视化端粒酶活性。使用该探针的荧光图像可以通过体内成像系统获得。如图所4a所示，可以观察到端粒酶触发的Au NCs探针发光增强。没有端粒酶或有端粒酶抑制剂的样品表现出相对微弱的信号。通常，端粒酶在大多数肿瘤类型中上调。本实验选择荷瘤小鼠作为端粒酶过度表达的动物模型。这些老鼠被分成四组。将探针通过尾静脉静脉注射到1组荷瘤小鼠体内。作为对照，探针也被静脉注射到健康小鼠体内。注射6h后，记录图像。图4b分别为荷瘤小鼠和健康小鼠的体内荧光图像。与正常小鼠相比，小鼠肿瘤组织表现出明显较强的荧光。

图1：探针的设计原理图

图2: (a) Au NCs的TEM图像。(b) Au NCs由核酸驱动组装后的TEM图像。(c)Au NCs 组装后的粒径分布。(d) A链的热熔曲线，A链TRP和相应区域的混合曲线，A链/TRP/ B链的整体曲线。(e) DNA整体的凝胶电泳分析。

图3：(a) 探针处理HeLa细胞后不同时间点的荧光图像。细胞核DAPI染色，呈蓝色放射。(b) 红色通道中不同时间点的荧光图像的线性轮廓。(c) 分别用探针和无TS引物的A链功能化Au NCs处理的HeLa细胞的荧光图像。细胞核用DAPI染色。

图4: (a) 在有无端粒酶的情况下使用该探针在活动物模型的荧光图像。(b) 以荷瘤小鼠为动物模型体内端粒酶荧光成像。

参考文献

X. Ran, Z. Wang, F. Pu, E. Ju, J. Ren, X. Qu, Nucleic acid-driven aggregation-induced emission of Au nanoclusters for visualizing telomerase activity in living cells and in vivo, Materials Horizons. 2021,

8, 1769-1775.