酶结合的硫胺二磷酸的计算表征显示出令人惊讶的稳定的三环状态：对催化的影响

硫胺二磷酸（ThDP）依赖性酶构成一大类催化各种反应的酶。许多涉及立体特异性碳 - 碳键形成，因此，已发现在各种生物催化应用中作为手性催化剂的兴趣和实用性增加。所有ThDP催化的反应都需要ThDP叶立德（辅助因子的活化状态）与底物的反应。鉴于辅因子可以在酶上采用多达七种状态，鉴定影响预反应物状态稳定性的因素对于全面理解各反应的动力学和机理是重要的。

在本文中，我们使用密度泛函理论计算系统地研究不同的辅因子状态的能量和几何形状。苯甲酰甲酸酯脱羧酶（BFDC）是一种充分表征的手性催化剂，用作原型ThDP依赖性酶。在可用的晶体结构的基础上构建活性位点的模型，并且在存在三种不同配体（结晶水，苯甲酰甲酸酯作为底物和（R）的情况下表征辅因子状态。） - 作为抑制剂的管理）。总之，计算表明，辅因子状态的相对稳定性受结合配体的存在和特性的影响很大。令人惊讶的发现是苯甲酰甲酸酯结合虽然有利于内鎓盐的形成，但为催化失活的三环状态提供了更大的稳定性。相反，抑制剂结合极大地使叶立德形成不稳定。总之，这些观察结果对ThDP依赖性酶的反应动力学具有重要意义，并且可能对这些反应中非天然底物的使用具有重要意义。

关键词： 结合位点; DFT; 酶机制; 量子化学计算; THDP依赖

依赖于硫胺二磷酸（ThDP，方案1）的酶可以在多种代谢途径中找到。虽然已知它们催化C-N，C-O和C-S键的形成，但ThDP依赖性酶通常催化邻近羰基的C-C键的分解和形成[1,2]。得到的2-羟基酮通常是手性的，因此这些酶在制备药物和农用化学品中作为生物催化剂的用途越来越多[3]。ThDP是一种不寻常的辅助因子，即使没有酶，它也可以催化许多这些反应[2]。例如，丙酮酸在水中的脱羧可以通过ThDP实现，但当它与酶丙酮酸脱羧酶（PDC）结合时，脱羧速率增加12个数量级[2,4]。显然，酶结合环境极大地增强了辅因子的催化能力。对如何实现这种增强的基本理解可能潜在地导致新的和改进的生物催化剂的开发。

至少，ThDP催化的反应都需要形成C2-碳阴离子或内鎓盐[5]（方案1）。这是通过一系列质子转移实现的，在此期间形成辅因子的几种不同状态[6]。从中性形式的ThDP（AP）开始，辅因子可以在N1'位置质子化，产生APH +状态。只有一个已知的例外[7]，N1'位置的质子化/去质子化是由高度保守的谷氨酸残基进行的，被认为可以稳定亚氨基互变异构体IP [6]。随后从APH +的 N4'中丢失质子给出IP状态。C2位置的去质子化产生内鎓盐形式，其可以在N1'位置被质子化（YIH +）或去质子化（YI）。认为C2去质子化是由N4'氮[2,8,9]进行的，并且辅助因子被保持在“V”构象中，其中亚氨基位于C2的氢键距离内。噻唑鎓环[9-14]。

虽然催化关键内鎓盐的重要性很容易被认识到，但获得4'-氨基和亚氨基互变异构体IP参与的证据证明更具挑战性。最初，模型化合物用于鉴定IP形式的ThDP 的特征UV吸光度。然后将这些用于证明酵母PDC上存在IP [15]。随后，IP形式显示在300-310 nm附近具有阳性CD信号，而在320-330 nm附近的负峰值，与ThDP与apo转酮酶结合时观察到的相似[16]，被指定为AP形式。[15]。现在已经观察到超过10种ThDP依赖性酶的这些以及进一步沿着反应途径的中间体的特征性CD和UV信号[ 6,17 ]。到目前为止，还没有观察到APH +形式的电子签名。然而，使用15 N和13 C标记的ThDP的固态NMR 已被用于鉴定丙酮酸脱羧酶和丙酮酸脱氢酶复合物的E1组分上的APH + [18]。

除了大量的实验研究之外，许多计算研究已经解决了关于ThDP的各种状态的问题。例如，在一些非常早期的工作中，Jordan使用半经验方法研究气相中辅因子的电子结构和构象空间，承认难以将这些结果与溶液和酶中的反应进行比较[19,20] ]。三十年后，密度泛函理论（DFT）计算表明，辅因子的4'-氨基部分可以接受或提供反应中的质子，这取决于N1'的质子化状态[21]。

IP / YIH +反应的轨道分析表明，叶立德的完全形成依赖于N1'的去质子化，并且与实验结果一致，去质子化反过来可能依赖于由底物的存在引起的构象变化[22]。最近，使用DFT方法获得了许多ThDP状态（AP，APH +，IP和YI）的相对稳定性，采用了辅因子模型以及氢键羧酸盐部分[23]。随后，使用类似的方法来表征N1'和N4'中心的亲核性[24]。在许多情况下，计算研究不是简单地关注辅助因子，而是用于研究ThDP酶的完整反应机制，包括丙酮酸脱羧酶（PDC）[25-28]，苯甲酰甲酸脱羧酶（BFDC）[29,30]，乙酰羟基酸合酶[24,31-35]，丙酮酸脱氢酶（PDH）[36]，苯甲醛裂解酶[37]，环己烷二酮水解酶[38]，草酰辅酶A脱羧酶[39]，DXP合成酶[40]和转酮酶[41， 42]。

令人惊讶的是，几乎没有一项研究承认ThDP辅助因子存在第二条（尽管讨论较少），即从AP形式中形成三环，二氢硫代噻吩物种[43-45]。N4'对C2的亲核攻击导致形成C2-N4'键，产生三环中间体TCH +。N1'质子TCH +的缺失将导致辅因子的TC形式[45]。虽然不常见，但已经在至少两种ThDP依赖性酶上观察到三环形式的辅因子。二氢硫代二磷酸二磷酸盐（TC）在短双歧杆菌 磷酸酮醇酶的X射线结构中观察到[46]，其羟乙基衍生物在肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合酶结构中被鉴定，其结晶已用丙酮酸浸泡[47]。

在最近的一项研究中，我们使用量子化学方法研究了苯甲酰甲酸脱羧酶（BFDC）的详细反应机制[29]。基于与底物类似物抑制剂（R） - 扁桃酸盐复合的BFDC的X射线结构设计活性位点的模型。在该研究中，定位和表征了所有中间体和过渡态。有趣的是，我们将辅因子的三环TCH +状态确定为非循环中间物种。发现其能量比IP低约5kcal / mol因此，提高了形成辅因子 - 底物加合物（C2α-甘露醇-THDP）的屏障。当然，这对任何BFDC催化反应的总体动力学都有重要意义，并且可能对所有THDP依赖性酶都有影响[29]。

这一意想不到的结果促使我们对ThDP的各种酶结合状态的能量学进行了系统研究（方案1）。为此，我们使用BFDC作为代表性的ThDP依赖性酶，并使用量子化学方法来研究BFDC反应机制以表征ThDP辅助因子的各种状态。已经生成了代表不同酶和非酶环境的模型，并且对于每种模型，辅因子已经在能量和几何形状方面进行了表征。