具有受保护的氮氧化物的亚磷酰胺结构单元，用于合成自旋标记的DNA和RNA

用2-硝基苄氧基甲基保护的TEMPO自旋标记与三种不同核苷的氨基残基连接：脱氧胞苷，脱氧腺苷和腺苷。相应的亚磷酰胺可以通过未修饰的标准方法掺入四种不同的自身互补DNA和两种RNA寡核苷酸中。光化学除去保护基，消除甲醛和自发空气氧化后，氮氧自由基以高收率再生。得到的旋转标记的回文双链体可以通过PELDOR光谱法直接研究，无需进一步的纯化步骤。通过PELDOR测量的自旋 - 旋转距离很好地对应于从分子模型获得的值。

关键词： EPR; 寡核苷酸; PELDOR; 光不稳保护

EPR光谱学已成熟，可用于研究核酸的结构和动力学[1-8]。尽管与NMR相比，EPR可获得的信息不太详细，但它通常是互补的。虽然局部构象通常来自NMR数据，但EPR可以测量NMR难以获得的长距离[9,10]。此外，生物聚合物的自旋标记可以通过顺磁弛豫增强支持核磁共振研究[11,12]。对于核酸，自旋标记通常通过共价连接氮氧化物来实现。不幸的是，已知通过亚磷酰胺化学组装寡核苷酸并用酶连接它们所需的条件部分地降解氮氧化物。通过合成引入自旋标记可以减少这个问题[13-24]。例如，从可转换核苷酸开始，通过4-氨基-TEMPO的亲核置换已被用于制备含有胞苷衍生物1及其腺苷类似物3的 RNA链[8,25,26]（图1））。或者，通过采用标准合成方法，可以通过亚磷酰胺结构单元将氮氧化物直接掺入寡核苷酸中[27-40]。然而，不可避免地会发生旋转标签的一些劣化。通过这种方式制备了通用结构2和4的氮氧化物标记的DNA链。

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图1：的TEMPO-标记的寡核苷酸和亚磷酰胺的结构5 - 8。

因此，近年来，我们开发了基于光不稳定保护基团的第三种策略[41-43]，最终导致亚磷酰胺6。该构建块在固相RNA合成中表现为任何正常的TOM保护的亚酰胺。它对于用于链组装，RNA去保护和酶促连接的条件是完全稳定的。已经应用Amidite 6合成用两种氮氧化物前体标记的全长TAR RNA。在最后一步中，通过在365nm处照射除去2-硝基苄氧基甲基。消除通过温和加热诱导的甲醛后，所得的羟胺自发地与空气反应以高产率形成硝基氧自由基[43]。。尽管Sigurdsson [31-33]，Hopkins [27,29]和Engels [20,21]引入的刚性自旋标记通常被认为对EPR研究有利，但根据结构1和3的 TEMPO修饰的RNA 已成功用于PELDOR实验确定两次旋转之间的距离[8,25,43]。这些结构单元的明显用途促使我们在本研究中将保护策略从亚酰胺6扩展到其DNA类似物5和腺苷衍生物7和8。

为了制备化合物5中，脱氧尿苷衍生物9 [44]是由磺酰活化，然后与受保护的TEMPO积木处理10 [43]以提供11（方案1）。脱乙酰化后，12的亚磷酸化直接导致亚克力5的数量级。与相应的氮氧化物相反，5的所有NMR光谱都很好地分辨，表明不存在任何顺磁性部分。

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方案1：亚磷酰胺的合成5。试剂和条件：（a）1 2,4,6-三异丙基苯磺酰氯，等3 N，4-二甲基氨基，CH 2氯2，0℃→室温，19个小时; 2.加入10，二异丙基乙胺，DMF，90℃，24小时; （b）MeOH，NaHCO 3，室温，2.5小时; （c）N，N-二异丙基氨基（2-氰基乙基）氨基磷酰氯，Et 3 N，CH 2 Cl 2，室温，20小时。

与化合物9不同，已知相应的肌苷衍生物在磺酰化后会产生混合物[30]，这种反应在我们手中产生的产率很低。因此，我们使用6-氯衍生物13作为起始原料，通过酶脱氨，乙酰化[37]和氯化可以容易地从脱氧腺苷中获得。该化合物干净地反应，得到67％的TEMPO共轭物14。在脱乙酰化（15）和三苯甲基化（16）之后，通过足够量的亚磷酸化获得亚酰胺结构单元7