用于光亲和标记的二氮杂萘官能化甘露糖苷

光亲和标记经常用于研究溶液中的配体 - 受体相互作用。我们采用了一种跨学科的方法来实现对凝集素FimH的轻度光标记，FimH是一种细菌蛋白，对粘附，定植和感染至关重要。在我们早期的工作之后，我们在这里设计并合成了二氮杂萘官能化的甘露糖苷作为高亲和力的FimH配体，并对最佳配体（甘露糖苷3）的光交联进行了广泛的研究。）与一系列模型肽和FimH。值得注意的是，我们采用了高性能质谱技术，能够以尽可能高的精度检测辐射结果。我们从这项研究中得出的结论是，FimH与糖二氮嗪的光标记仅取得了非常有限的成功，并且不能被视为共价修饰FimH的简便方法。

关键词：二 氮杂萘; 对接; FimH; 凝集素配体; 甘露; 质谱; 光亲和标记

研究蛋白质及其配体（如凝集素和碳水化合物）之间的相互作用对于理解许多生物过程具有根本重要性。几种不同的方法用于阐明配体 - 蛋白质相互作用。除X射线晶体学外，溶液研究在分子识别研究中增加了有价值的信息，因为它们考虑了分子动力学和溶剂效应。在后一方面，光亲和标记已经发展成为在生理条件下进行研究的有用工具[1-4]。光亲和标记需要配备有光不稳定基团的配体，其可以在用适当波长的光照射时转化为高反应性中间体。该技术涉及将光不稳定配体与靶蛋白（受体）一起孵育并照射配体 - 蛋白质复合物以形成激发的中间体，其最终产生共价交联的配体 - 受体缀合物，其必须通过质谱法鉴定（图1）。

三种广泛使用的光反应性基团是芳基叠氮化物，二苯甲酮和二氮杂萘。它们的立体特性，光化学和反应性不同。为了应用于生物环境，激活光不稳定配体所需的光的波长必须是生物相容的。此外，小光子是理想的。Diazirines特别满足这些要求。二氮杂萘光光团很小，并且在350nm附近的波长下可以进行光活化，因此不会扰乱蛋白质结构。根据文献，二氮嗪官能化配体的照射产生反应性卡宾，其可以快速反应插入蛋白质的OH，NH或CH基团[5,6]。二氮杂萘基团的其他优点是其在不同pH值下的稳健性和对亲核试剂的稳定性。然而，除了所需的插入反应之外，卡宾还可以经历不希望的副反应，特别是通过提取α-H原子形成烯烃。因此，引入芳基（三氟甲基）二氮杂萘，其在二氮杂官能团的α-位缺乏氢原子，因此不形成烯烃。因此，芳基（三氟甲基）二氮杂嗪已成为光标记研究的首选试剂[7,8]。

几年来，我们的目标是利用二氮杂萘标记的甘露吡喃糖苷进行蛋白质标记。在这项工作的过程中，我们逐步改进了我们的目标设计和合成程序[9-11]，目的是最终解决细菌凝集素FimH。最后，在2010年，我们使用质谱法分析了用三种不同的糖二氮嗪对八肽血管紧张素II的光标记，然后还用相同的三种甘露糖苷检测了FimH的光标记。但是，我们无法完全准确地测量标签产品[11]。虽然这些结果甚至在最近的评论中得到了认可[12]不幸的是，他们没有帮助巩固我们关于FimH的光亲和标签的项目，但是这种方法在我们手中仍然存在问题。迄今为止，还没有可靠的FimH光标记配体。

我们推断，基于高效质谱的蛋白质组学可以在我们采用量身定制的糖配体进行FimH标记的方法中取得更大的成功。在这里，我们报告了FimH标记的困难，即使计算机辅助设计和光不稳定FimH的合成与优化的光标记条件和高端质谱相结合。

FimH是在粘附细胞器（1型菌毛）的尖端处发现的菌毛凝集素，其从肠杆菌科（例如大肠杆菌）的表面突出。菌毛介导细菌与其靶细胞糖基化表面的牢固附着（粘附），并构成细菌感染的重要毒力因子，如尿路感染[13-16]。因此，FimH是药物化学和蛋白质组学中一种有趣的靶蛋白[17,18]。它是一种双结构域蛋白，其包含宿主α-D-甘露糖特异性碳水化合物结合位点的凝集素结构域FimH L和将蛋白质连接到菌毛轴的菌毛蛋白结构域FimH P（图2）。

具有对接的对硝基苯基α-D-吡喃甘露糖苷（1，p NPMan）的FimH晶体结构（pdb代码1KLF）。FimH是双结构域蛋白质，其包含具有碳水化合物结合位点（顶部）的凝集素结构域（FimH L）和将凝集素锚定在菌毛轴上的菌毛蛋白结构域（FimH P，底部）。对于光亲和标记，使用截短形式的蛋白质（FimH tr）。碳水化合物结合位点描绘为Connolly表面并根据静电势着色。图片是通过滑行生成的，并使用maestro渲染，两者都在Schrödinger软件中实现。

α-D-吡喃甘露糖苷配体的络合涉及整个甘露糖苷糖苷部分，而糖苷配基部分伸出结合位点，经历与蛋白质表面的相互作用，这增加了亲和力。特别是糖配体与Y48和Y137侧链的CH-π或π-π相互作用，称为“酪氨酸门” [19,20]，已知可显着提高特定甘露糖苷对FimH的亲和力。因此，具有芳基糖苷配基的α-D-吡喃甘露糖苷如对硝基苯基α-D-吡喃甘露糖苷（1）和方形酸衍生物2 [19]（图3））被鉴定为具有相对高亲和力（低微摩尔范围）的FimH配体。基于这一认识，我们提出了三个吖丙因标记的甘露糖苷3 - 5作为FimH的光不稳定的配体，并通过计算机辅助评估对接其潜在的亲和力。