针对假单胞菌喹诺酮信号群体感应系统发现新型抗感染病原体

革兰氏阴性机会致病菌铜绿假单胞菌引起严重的医院感染。它使用群体感应（QS）来调节和协调感染过程中的群体范围的群体行为，如毒力因子的协同分泌。一个非常重要的信号网络是假单胞菌喹诺酮信号（PQS）QS。为了设计新颖和创新的抗感染药物，已经设计了抑制剂以解决pqs QS中存在的各种潜在药物靶标。这些范围从信号分子PqsABCDE的生物合成级联内的酶到这些自诱导物PqsR（MvfR）的受体。该评论不久将介绍铜绿假单胞菌它的致病性状由pqs系统调节，并突出了已发表的药物发现工作，提供了对化合物结合模式的见解（如果有的话）。此外，讨论了各个目标对于阻塞器设计的适用性。

关键词： 抗感染药; pathoblockers; PQS; 铜绿假单胞菌 ; 群体感应

近年来，人们试图提高公众对抗菌素耐药性（AMR）的认识以及它对现代健康标准的巨大威胁[1]。令人震惊的是，随着可用治疗方案的增加，在根除细菌感染方面证明无效[2]。特别是在革兰氏阴性菌的情况下，已经确定了对新药的迫切需求，而候选药物的管道实际上是干燥的，并且“大药房”中抗生素药物研究的黄金时代的理想复兴目前不是在地平线上看到[3,4]。尽管如此，在过去的几十年中，人们已经设计出一些创新的策略来探讨它们在抗击细菌感染方面的临床应用[6-7]。与处理涉及细菌细胞重要过程的经典抗生素药物靶标相反，“抗病毒”策略旨在消除致病特征而不影响细胞活力，为较低的药物诱导选择压力提供基础[5,8,9]。因此，预计阻力发展率会降低[9]。最近通过批准毒素中和治疗性抗体bezlotoxumab提供了这种非常规策略的临床概念验证，该抗体因此在临床上用于先发性治疗复发性梭菌感染[10]。因此，已经公布了活性成分的潜力，这些原理不会通过杀菌或抑菌作用杀死细菌，而是通过对毒力机制的病原体特异性作用介导它们的作用。这篇简短的综述重点介绍了针对重要病原体铜绿假单胞菌的一种特定抗病毒策略的现有知识，该策略是基于对假单胞菌喹诺酮信号群体感应系统（pqs QS）的破坏。

铜绿假单胞菌的耐药性及临床意义

铜绿假单胞菌是一种威胁性的ESKAPE病原体，并且经常被称为“超级细菌” [11]。2017年，世界卫生组织（世卫组织）公布了一份病原体优先清单，迫切需要新的治疗方案，碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌被评为最高级别“关键” [12]。我们对这种革兰氏阴性细菌面临的主要问题之一是它通过几种机制显示出抵抗抗生素治疗的显着能力。首先，它具有对许多抗生素的固有抗性，因为其细胞壁的渗透性低，并且由于许多外排泵以及β-内酰胺酶的作用。特别是外流泵是由几种蛋白质组分组成的漂亮的分子机器，其总长度从细胞膜的内侧到外侧。它们的功能是排出多种异生素，其中包括来自头孢菌素，碳青霉烯，氟喹诺酮和氨基糖苷类的抗生素[13]。。通过这种机制，这些药物无法到达其细胞内目标，使其无效。另一方面，β-内酰胺酶特异性地作用于携带同源环状部分作为活性驱动基序的化合物，并且发现它们的基因编码在许多铜绿假单胞菌菌株的染色体上。因此，这些抗生素失活酶提供对青霉素和头孢菌素的抗性[14]。

除了这些内在能力外，铜绿假单胞菌还能够获得与其接触的抗生素的抗药性。这些获得性抗性可能是编码靶蛋白的基因自发突变的结果。例如，DNA促旋酶内的某些突变会导致氟喹诺酮类药物的易感性降低[15]。其他例子是导致外排泵过度表达的突变体[15]。如果抗性决定簇位于可转移的质粒上，它可以通过水平基因转移在细菌中有效地传播，这可能是获得性抗性发展的最常见机制[15]。。在这些情况下，抗性决定簇是可遗传的并传递给下一代细菌。

此外，已经发现了一种机制，称为适应性抗性，并描述了持续性环境刺激可以诱导非突变抗性的观察[15]。在连续治疗方案下，抗生素本身当然可以是刺激物。但是，营养素缺乏，pH值，厌氧生物以及生物杀灭剂，多胺，阳离子和碳源也可能成为导致适应性抗性的外部触发因素。这些刺激的共同作用似乎是表达模式的改变，最终影响例如外排泵或酶活性，以及细胞包膜特性或生物膜形成[15]。

上述所有机制都有助于解释已确定的慢性铜绿假单胞菌感染难以根除的观点。这种普遍存在的机会致病菌基本上可以在人体的每个生态位中引起感染[16]。常见的感染部位是呼吸道和泌尿道，眼睛和伤口，例如烧伤引起的伤口[17]。这些经常发生在住院治疗的，尤其是免疫功能低下的人群中。患有囊性纤维化（CF）或支气管扩张等慢性肺病的患者在铜绿假单胞菌时预后不良检测到定植，因为这通常与肺功能丧失，发病率和死亡率有关[18]。2013年，据估计，到18岁时，80％的CF患者是假单胞菌阳性。最近，有证据表明这一比例在下降[19]。然而，随着年龄的增长，大多数CF患者将长期感染铜绿假单胞菌，这仍然是与这种遗传疾病相关的主要死亡原因[20]。重要的是，已经描述了这些患者中基于喹诺酮的群体感应量（pqs QS; vide infra）与阴性预后相关，并且可能作为感染严重程度的可能生物标志物[21]。

Quroum传感（QS）

通常，术语群体感应描述了群体密度依赖的细胞 - 细胞通信系统，其利用小的可扩散分子作为信号传导剂。通过这种方式，致病菌可以协调全人群的表达模式变化，并调节在感染过程中重要的协同群体行为。致病因子特征如毒力因子的产生或生物膜形成受这些系统的控制。实际上，标题病原体利用四个相互交织的QS系统，称为las，rhl，pqs和iqs [22]。这些子系统相互影响，建立了一个错综复杂的监管网络，其补偿机制确保了环境适应性和对相关毒力基因的微调控制（图1））。所有这四项研究都是为了追求群体感应抑制剂（QSI），用作铜绿假单胞菌致病性的阻断剂[11,23]。

通常，革兰氏阴性的QS系统由转录调节因子，信号分子和参与后者合成的一种或几种酶组成。调节剂通常控制生物合成酶的转录，并且还作为信号分子自身的受体起作用。由于这些实际上是自诱导物（AIs），因此对其受体具有激动活性，因此产生了正反馈回路。迄今为止，在铜绿假单胞菌中已鉴定出三种不同的AI化学型：las和rhl系统使用的烷基高丝氨酸内酯（AHL），pqs系统使用的烷基喹诺酮（AQs）和2-（2-羟基苯基）噻唑-4 - iqs系统使用的甲醛（图1）。针对las和rhl的策略已在其他地方进行了审查[5,11]，迄今为止已有一项关于iqs抑制的研究[23]。基于针对QSI的pqs的设计和优化，已经发表了许多针对有效病原体阻滞剂的药物发现工作，这是本综述的主题。

pqs QS系统的生物合成级联

PQS是假单胞菌喹诺酮信号的缩写，实际上是指信号分子2-庚基-3-羟基喹啉-4（1H） - 酮（图2）。这种基于喹诺酮的AI及其生物合成前体HHQ（2-庚基喹啉-4（1H） - 酮）是称为“多重毒力因子调节剂”（MvfR）的转录因子的配体，也称为PqsR。通过与该受体的相互作用，HHQ和PQS诱导多种基因的转录，包括它们自己的生物合成酶级联（PqsABCDE）。这些酶与来自las QS系统的LasR控制的PqsH和PqsL一起设法从邻氨基苯甲酸构建PQS和相关分子（图2））。这个初始构建模块可以通过从色氨酸开始的犬尿氨酸途径或来自PqsR控制的phnAB操纵子的邻氨基苯甲酸合酶来提供，从使用chorismic酸作为来源开始[24]。无论哪种方式，连接酶PqsA通过将邻氨基苯甲酸与辅酶A缩合而开始PQS合成[25]。然后将所得的活化硫酯（anthraniloyl-CoA）转移至β-酮酰基-ACP合酶III（FabH）型酶PqsD的活性位点半胱氨酸[26,27]。随后，另一种CoA活化的基质发挥作用。与脂肪酸合成类似，丙二酰辅酶A与酶结合的硫酯反应，在脱羧作用下产生2-氨基苯甲酰乙酰-CoA（2-ABA-CoA）[28,29]。在下一步中，途径特异性硫酯酶PqsE产生2-氨基苯甲酰乙酸（2-ABA）[29]。已经表明，铜绿假单胞菌中存在的广泛特异性硫酯酶TesB 也可以催化这种反应[29]。喹诺酮核心通过异二聚体复合物PqsBC的作用形成。这次，CoA活化的辛酸用于通过硫酯键预加载PqsC的活性位点半胱氨酸与脂肪酸[30,31]。之后产生的2-ABA然后在脱羧缩合下从HHQ消耗[30]。最后，PQS是通过NADH依赖性黄素单加氧酶PqsH对位置3进行羟基化而产生的[32]。

该生物合成级联还负责产生pqs相关代谢物DHQ，2-AA和HQNO以及具有不同长度的烷基链的其他AQ [29,30]。上述酶PqsL是产生HQNO所必需的，因为它提供了N-氧化底物2-HABA，用于PqsBC介导的缩合，其中辛酰基-CoA类似于HHQ生物合成[27]。

PQS介导的致病性和分子靶点

铜绿假单胞菌利用毒力因子库和其他致病性特征在感染过程中压倒和定殖宿主[5]，而pqs QS在其中许多调节中起着至关重要的作用。令人惊讶的是，182个基因的表达在外源性PQS中发生了改变[33]。已经收集了证据，这些效应是通过直接的PqsR依赖性作用或通过PqsR非依赖性机制介导的，这很可能是由于PQS的铁螯合作用和抗氧化作用[33]。此外，已经解释了硫酯酶PqsE，其生物合成功能因铜绿假单胞菌中存在替代硫酯酶而不必要。，实际上也是pqs QS 的主要效应分子[33]。通过一种尚未知的机制，这种酶调节145个基因，而其中只有30个与PQS调节子重叠。似乎这两个是pqs QS响应的主要调解者。就致病性而言，它们参与编码负责吩嗪生物合成（绿脓菌素产生），氰化氢合成，凝集素LecA和LecB的酶的基因的调节，以及参与生物膜形成的其他基因，用于鼠李糖脂合成的酶，抗性 - 由mexGHI编码的结瘤 - 细胞分裂（RND）外排泵- opmD操纵子，3型和6型分泌物的组分以及外毒素ExoS和铁载体合成酶[33]。

除毒力调节外，PQS分子还有一些显着的继发效应[34]。这种自诱导剂已被描述为介导铁的获得，细胞毒性，外膜囊泡生物发生，并发挥宿主免疫调节作用[34,35]。有趣的是，PQS和HHQ能够干扰核转录因子-κB和缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，从而下调宿主先天免疫系统[36,37]。其他PQS相关代谢物已被证明具有额外的作用。例如，HQNO诱导细胞外DNA自溶和释放，从而促进生物膜形成和增加美罗培南耐受[38]。HQNO通过抑制真核生物的细菌和线粒体的呼吸链中的复合物III起作用，因此，它可以被认为是一般的细胞毒性剂。DHQ是PQS生物合成途径的分流产物，对秀丽隐杆线虫模型中的铜绿假单胞菌毒力很重要，并且对上皮细胞具有生长抑制作用[26,39]。最后，已经描述了2-AA对于持久性细胞形成是重要的，这是一种非常重要的抗生素治疗耐受机制[40]。

在由pqs QS直接或间接控制的毒力因子中，绿脓菌素是最突出的之一。这种氧化还原活性色素负责铜绿假单胞菌培养物的绿蓝色。似乎活性氧的产生是绿脓菌素细胞毒性的主要机制[41]。已知这种三环化合物可诱导中性粒细胞凋亡，但也可增强中性粒细胞胞外陷阱的形成[42,43]。这两种机制都会损害中性粒细胞介导的宿主防御。此外，有人假设绿脓菌素作为细胞外电子穿梭机，在厌氧条件下有助于生物膜中铜绿假单胞菌细胞的氧化还原稳态[44]。。

由于这些重要的毒力机制，直接或间接控制pqs QS，以小分子化合物为目标，从而阻断铜绿假单胞菌致病性，非常有吸引力。然而，这种复杂的生物合成途径和效应分子网络使得选择干预的完美点变得困难。由于它们在AQ合成中具有相当外围的作用，PqsH和PqsL迄今尚未引起QSI发现的重大关注。然而，主要生物合成级联pqsA-E的所有酶以及信号分子受体PqsR可能是有价值的药物靶标。而且，能够调节多于一种靶标的试剂可能是有意义的。问题是，在QSI处理后，这些靶标和/或组合中的哪一个断言最相关的毒力减弱表型。