能够调节肠道沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌中SdiA群体感应受体的非天然自诱导剂类似物

群体感应（QS）允许许多常见的细菌病原体协调群体行为，例如毒力因子产生，宿主定植和高人口密度下的生物膜形成。这种细胞-细胞信号传导过程是通过调节ñ -酰基-L-高丝氨酸内酯（AHL）信号，或自体诱导物，和蛋白LuxR型受体在革兰氏-阴性细菌。SdiA是一种孤儿LuxR型受体，存在于埃希氏菌，沙门氏菌，克雷伯氏菌和肠杆菌中。响应其他物种产生的AHL信号并调节参与宿主定植的几个方面的基因的属。使用靶向LuxR型受体的非天然小分子抑制QS提供了用于研究和潜在控制这些细菌中的毒力的非杀生物方法。迄今为止，很少有研究表明AHL和其他能够SdiA激动的小分子的特征，并且没有报道过SdiA拮抗剂。在这里，我们报告筛选一组AHL类似物既发现SdiA的激动剂和拮抗剂，又开始描述SdiA：AHL相互作用的结构 - 活性关系（SAR）。在肠沙门氏菌中使用SdiA的基于细胞的报告基因鉴定并表征了几种非天然SdiA激动剂和第一组SdiA拮抗剂鼠伤寒沙门氏菌。这些化合物代表了新的化学探针，用于探索SdiA在感染过程中发挥作用的机制及其在种间相互作用中的作用。此外，由于SdiA在体外产生时高度稳定，这些化合物可以推进LuxR型受体的基础研究：配体相互作用，产生激动和拮抗作用。

关键词： N-酰基L-高丝氨酸内酯; LuxR型受体; 群体感应; 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）; 可持续发展影响评价

在对抗细菌感染的过程中，微生物比医学界具有决定性的优势：进化[1]。使用杀菌或抑菌化学疗法来治疗感染会产生进化压力，从而推动细菌群体内和细菌群体之间的快速抗性发展和扩散[2,3]。几乎所有已知的抗生素都观察到抗生素耐药临床分离株，新抗生素发现的步伐已经落后[4]。近年来，非杀菌方法已成为一种治疗感染的新治疗策略，可能具有较小的耐药性发展和传播倾向[4-6]。干扰毒力表型的调节代表了一种这样的补充抗生素的方法，并且在这方面截获细菌中的群体感应（QS）引起了相当多的关注[7-9]。

QS是一种种内和种间化学通讯，已发现在许多常见的细菌病原体中发生[10,11]。这些病原体利用QS协调群体有益行为，如毒力因子产生，宿主定植和高人口密度的生物膜形成[12]。革兰氏阴性细菌通常使用N-酰基L-高丝氨酸内酯（AHL）信号用于QS，其由LuxI型合成酶产生并由细胞内LuxR型受体感知（图1A）[13]。AHL信号以低但恒定的基础水平产生，并迅速扩散到当地环境中。随着人口的增长，AHL的浓度也在增加，一旦达到细胞内水平阈值（从而达到了“法定人数”），就会产生高效的AHL：LuxR型蛋白质结合，激活各种基因的转录。群体行为。SdiA是在沙门氏菌，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属和柠檬酸杆菌属中发现的LuxR型受体同源物[14]。有趣的是，这些物种没有LuxI型合成酶，也不产生AHL; 因此，SdiA代表一种孤儿[14]或“独奏”LuxR型受体，一类数量迅速增长[15]。SDIA从公共食源性病原体，肠道沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（S.鼠伤寒沙门氏菌下文），一直是研究的目标[16-19] ，并且具有从其它属与SDIA高的序列同一性：例如，S.鼠伤寒沙门氏菌（基因库登AAC08299 .1）SdiA与大肠杆菌（GeneBank AWF10864.1）SdiA 72％相同，与肺炎克雷伯菌（GeneBank CDO1572.1）SdiA 67％相同，71％与肠杆菌（GeneBank AFN80302.1）SdiA相同，84％与Citrobacter koseri（GeneBank SQB29462.1）SdiA相同。

S.鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌中 SdiA的早期研究通过从质粒中过表达SdiA来鉴定低水平的AHL非依赖性SdiA活性[23-26]。然而，曾经迈克尔等人。[16]发现，在SDIA S.伤寒响应外源提供的信号分子自然，AHL-依赖SDIA调节子被确定在两个S.鼠伤寒沙门氏菌[27,28]和大肠杆菌 [14,29-31] 。在S. Typhimurium中，SdiA促进pefI，srgA- E和rck的 转录[ 28,32 ]。pefI和srgA是质粒编码的菌毛（pef）操纵子的成员; PefI负调节pef操纵子，SrgA是二硫键氧化还原酶，参与正确折叠PefA，一种菌毛亚基[33]。SrgB-D的功能尚不清楚[28]。SrgE是一种III型分泌效应物，但其目标尚不清楚[19]。最后，RCK（电阻，以补充杀灭）具有两个公知的功能是感染关键：RCK赋予对人补体电阻并负责通过该拉链机构S.鼠伤寒沙门氏菌侵入宿主细胞[34,35] 。

其他物种在沙门氏菌和大肠杆菌环境中产生的AHL 被认为对SdiA功能至关重要。例如，在SDIA S.伤寒已被证明在的AHL-产生病原体小鼠的消化道中存在被激活（产生有机体：小肠结肠炎耶尔森菌）[18]和海龟（产生有机体：嗜水）[17]。此外，引入的LuxI型合酶（通过质粒）为S.鼠伤寒沙门氏菌的竞争优势提供的病原体在超过细菌定植小鼠缺乏质粒[18] 。同样，肠出血大肠杆菌（EHEC）需要牛瘤胃中其他物种产生的SdiA和AHL，以便定殖牛[19,36]。这些结果强烈表明SdiA在该病原体家族的毒力中的重要性。然而，尽管有这些发现，SdiA在QS和促进存活和宿主定植方面的确切作用仍然知之甚少。

我们缺乏机械理解SdiA在毒力中的作用，这可能是由于在体外产生和操纵SdiA的能力所弥补的。实际上，相对于其他LuxR型受体，SdiA似乎更稳定，更易于体外表征，并且有望用于生物物理表征[21,22,37]。LuxR型蛋白质由两个结构域组成：较大的N-末端配体结合结构域（LBD）连接到较小的C-末端DNA结合结构域（DBD）。2006年，在存在和不存在AHL的情况下，通过NMR解析了EHEC SdiA LBD的结构，并证明了配体结合后折叠和结构的增加[37]。最近，两组报告了在存在四种天然存在的AHL的情况下全长EHEC SdiA的X射线晶体结构作为同型二聚体（如图1B所示）[21,22]。这些研究揭示了SdiA二聚体的结构，其结合了LBD和DBD结构域，与其他报道的全长LuxR型蛋白（即TraR和QscR）相当[21,22]虽然有可能指导最终装配的不同域间相互作用。尽管报道了这些结构，但我们对LuxR型受体激活（或失活）中涉及的非天然配体 - 受体相互作用的理解仍然很差。在没有激动剂配体的情况下，大多数LuxR型蛋白质在体外高度不稳定，并且在拮抗剂存在下这种不稳定性通常会增加[38]。因此，在AHL不存在和存在的情况下观察到的体外EHEC SdiA的稳定性提供了开始描绘AHL的新的且潜在的强有力途径：LuxR型受体相互作用，其产生激动作用，并且可能产生拮抗作用[21]。 ，22]。这些研究将需要能够具有SdiA激动和拮抗作用的AHL型配体。

调节许多不同LuxR型受体活性的非天然配体已被用于描述各种QS系统的机制，以了解QS在感染中的作用，并减弱野生型细菌中的毒力表型。他们的本土宿主的存在[38-50]。这些化合物中的大多数基于AHL支架。相对于这些先前的研究，SdiA的小分子探针的开发滞后。实际上，据我们所知，在任何细菌物种中，只有两个关于SdiA中AHL型配体活性的实验研究的报道，并且没有报道过拮抗剂。第一项研究涉及Michael等人的发现。[16]那个S.。鼠伤寒实际上响应外源天然AHL（参见上文），通过测试C4，C6，C8，C10和C12 AHL以及它们的3-氧代类似物证明。2007年，Janssens等人。其特征在于一个小信号分子集合中的在SDIA从效力（如外消旋混合物）S.鼠伤寒沙门氏菌具有不同尾长（4-14个碳），氧化水平在尾部β -碳，和内酯头组替代[20] 。一种AHL，N- （3-氧代辛酰基）DL-高丝氨酸内酯（DL-OOHL，如图1B所示）被确定为SdiA的最佳天然AHL（EC 50 = 3 nM，使用基于细胞的SdiA报告基因测定） ）及其同型半胱氨酸硫代内酯类似物（图1B发现其效力是三倍（EC 50 = 1 nM）。我们试图在目前的工作中建立这些先前的研究，并确定扩大的SdiA合成配体范围。

在这里，我们报告AHL的焦点库的筛选类似物在从SDIA受体活性S.鼠伤寒沙门氏菌。使用SdiA发光报告系统在激动和拮抗测定中测量化合物功效和效力，并在大肠杆菌 SdiA报道分子中进行后续研究。结果提供类型AHL支架可以激动和拮抗的的广泛画面S.鼠伤寒沙门氏菌SDIA，允许关键结构-活性关系（SARS），用于SDIA活性的调节的定义。这些化合物代表了探索SdiA和QS在S中作用的新化学工具。 鼠伤寒感染，用于表征非天然AHL与LuxR型蛋白质相互作用的机制，以及用于开发针对SdiA的新型抗病毒策略的途径。