用于合成配体靶向荧光标记的螯合肽缀合物作为癌症的治疗工具的新型固相策略

在本文中，我们成功地设计并展示了一种新的连续方法，用于组装靶向配体，肽类间隔区，荧光标签和螯合核心，用于以高产率在标准Fmoc固相肽合成中附着细胞毒性分子，放射性示踪剂，纳米材料。和纯洁。差异保护的Fmoc-Lys-（Tfa）-OH在连接荧光标签的同时以不间断的方式生长肽链起着至关重要的作用。该方法适用于对酸性敏感的侧链氨基保护基团如Trt（氯三苯甲基），Mtt（4-甲基三苯甲基），Mmt（4-甲氧基三苯甲基）敏感的对弱温和强酸性条件敏感的固相树脂。合成配体靶向荧光标记的生物缀合物。使用这种方法，DUPA罗丹明B结合物（DUPA = 2- [3-（1,3-二羧基丙基）脲基]戊二酸），靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA），表达于前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌和脑癌，翼状罗丹明B，靶向叶酸已经合成了诸如卵巢，肺，子宫内膜的受体阳性癌症以及炎性疾病。使用LNCaP（PSMA + ve），PC-3（PSMA-ve，FR-ve）和CHO-β（FR + ve）细胞系的体外研究及其各自的竞争实验证明了新合成的生物结构对未来应用的特异性。在荧光引导的术中成像。已经合成了靶向叶酸受体阳性癌症，例如卵巢，肺，子宫内膜以及炎性疾病。使用LNCaP（PSMA + ve），PC-3（PSMA-ve，FR-ve）和CHO-β（FR + ve）细胞系的体外研究及其各自的竞争实验证明了新合成的生物结构对未来应用的特异性。在荧光引导的术中成像。已经合成了靶向叶酸受体阳性癌症，例如卵巢，肺，子宫内膜以及炎性疾病。使用LNCaP（PSMA + ve），PC-3（PSMA-ve，FR-ve）和CHO-β（FR + ve）细胞系的体外研究及其各自的竞争实验证明了新合成的生物结构对未来应用的特异性。在荧光引导的术中成像。

关键词： 螯合连接子; 共聚焦研究; 连续合成工艺; 荧光标签; 将Fmoc-赖氨酸- （TFA）-OH; 前列腺癌和卵巢癌; 固相肽合成

对细胞过程的理解对于通过靶向给药技术设计诊断和治疗癌症和炎性疾病的新策略是必不可少的[1]。通过将荧光探针或放射性示踪剂标记为靶向配体来辨别细胞中的复杂分子过程，所述靶向配体在与患病条件下过表达的细胞表面蛋白结合后将经历内化。内化示踪剂连同靶向配体充当跟踪分子，以了解递送的货物或生物制剂的目的地。通过特定的生物标志物对癌症和炎症性疾病进行生物成像[2]开发了几种方法，包括单正电子发射计算机断层扫描（SPECT），正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI），每种方式都有自己的优点和缺点[3]。然而，在检查病理性疾病状态期间，使用荧光探针[4]或放射性同位素[5,6]的成像研究提供了实时，非侵入性，高分辨率的图像。

前列腺特异性膜抗原（PSMA）[7-9]和叶酸受体[10-13]被充分表征，并且最有吸引力的癌症生物标志物分别存在于前列腺癌和卵巢癌的原发和转移阶段。PSMA属于在前列腺，脑，膀胱和乳腺癌的细胞表面上过表达的II型膜结合糖蛋白家族。而叶酸受体通过糖磷脂酰肌醇锚固定在细胞膜上，并在炎症期间在几种癌症以及活化的巨噬细胞上过表达。此外，还发现叶酸受体在活化的巨噬细胞上过表达[14]，但在静息巨噬细胞上没有过表达[15]。。许多炎症性疾病，如类风湿性关节炎，炎性骨关节炎，缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化，牛皮癣，血管炎，狼疮，糖尿病，肾小球肾炎，结节病，克罗恩病和干燥综合征都是由活化的巨噬细胞引起的[16]。最近EC17，（λex = 465-490 nm和λem = 520-530 nm）叶酸和异硫氰酸荧光素的结合物已被用于卵巢癌术中手术[17]，肺腺癌[18-20]和乳腺癌[21]。因此，针对这些生物标记物提供了新的见解，以了解这些疾病的原因和治疗方法。这些生物标志物属于细胞表面跨膜蛋白家族[22]，主要在患病组织中过度表达，并被用于提供化学工具，用于早期诊断恶性肿瘤[23]和炎症性疾病。它们也用于靶向给药[24,25]用于避免对正常和健康细胞的任何非现场毒性的治疗剂。遗憾的是，构建诊断和治疗化学工具的策略很少发展，所述化学工具由多肽间隔物，用于生物标记的归巢配体，荧光标签和用于使用固相肽合成在连续过程中束缚货物的螯合部分组成。用于制备生物结构的传统固相肽合成方法采用商业树脂中存在的正交保护的功能部分，例如Universal Nova标签或超酸不稳定树脂，例如Rink酸[26]，4-羟甲基苯氧基丁酰基（HMPB），氯三苯甲基[27]，SASRIN [28]和Sieber酰胺[29]。即使这种树脂非常有用，它们也有几个缺点。例如，i）它们成本无效，ii）具有低树脂负载，iii）在中等至强酸性[30]或用于脱保护偶联氨基酸的基本条件下不相容，并且iv）从固体支持物过早切割多肽链在酸敏感性侧链保护部分的去保护过程中产生中等产率以引入荧光标签。

除了上述缺点之外，用于合成靶向荧光标记的生物缀合物的常规方法[31]是固相和溶液相合成的混合方法[32]。这些涉及分离副产物和未反应的荧光组分的几个中间纯化步骤。此外，有报道称，仅通过采用溶液相化学法合成了受体靶向多模式工具[33-35]。这些多步骤合成方案导致术中成像工具的成本升高，否则将通过我们的方法通过单个纯化步骤产生。即使是Universal Nova标签树脂[36]（图1a）在某种程度上解决了这个问题，它在使荧光标签与肽间隔物连接之前遇到使用酸性条件使侧链4-甲氧基三苯甲基（Mmt）氨基保护基脱保护的问题。这导致肽链的过早裂解和生物缀合物合成期间化学产率的损失。此外，连接含有酸敏感官能团和氨基酸半胱氨酸的放射性示踪剂螯合核心也是麻烦且具有挑战性的。最近，Low等人。报道了各种靶向缀合物的合成，其中荧光标记[37]已经在溶液相反应中附着。此外，他们报道了含有放射性示踪剂片段的配体结合肽的合成[38] 没有使用在强酸性条件下裂解的Wang树脂的荧光标签。

与上述缺点相反，本发明的手稿引出了一种新的合成策略，用于在连续过程中用几种组分构建新的生物结构而不分离任何中间体。组装的各种组分包括细胞表面蛋白质识别配体，用于增强溶解度和结合亲和力的肽间隔物，用于组织染色的荧光标签和用于连接治疗性货物的螯合核心。通过策略性地引入差异保护的二元氨基酸如赖氨酸，其α-和ε-氨基被保护为碱不稳定的Fmoc和三氟乙酰基（Tfa）保护基，可以在高化学产率和纯度下顺利实现该目标。图1b）。该方法是通用的，并且对于含有酸不稳定的正交氨基酸与4-甲氧基三苯甲基（Mmt）和4-甲基三苯甲基（Mtt）保护基团的酸敏感树脂可以是非常有用的。