3,5-二取代异恶唑衍生物的合成

区域选择性铜（I） - 催化的芳族腈氧化物的1,3-偶极环加成反应，由相应的粗亚氨酰氯原位产生，和非对称活化的炔烃，得到3,5-二取代的异恶唑衍生物。为此，首先通过与羟胺的反应将芳族醛1转化为相应的醛肟2，并将粗反应产物转化为相应的亚氨酰氯3，其直接用于下一步而无需纯化。将催化量的碘化铜（I）和碱如KHCO 3加入到含有粗亚氨酰氯3和非对称活化炔烃的水溶液中。4。原位产生的芳族腈氧化物5经过原位形成的铜（I）乙炔化物的加成，得到3,5-二取代的异恶唑6-11，为单一异构体，产率中等至良好（方案1）。

粗酰亚胺酰氯3和非对称活化的炔烃4之间的所有反应在室温下在水溶液中进行。最终的3,5-二取代异恶唑很容易通过过滤分离，用水洗涤并重新溶解。

3,5-二取代的异恶唑6，7，9和10（表1）先前已经通过不同的合成方法制备，但化合物6 [52] ，7 [49]和10 [53]已经被仅部分地表征，而对于化合物9 [54]没有报道表征数据。

基于化学和光谱分析（IR，1 H，13 C和15 N NMR光谱）明确指定3,5-二取代的异恶唑结构。NMR光谱清楚地表明，对于所有合成的3,5-二取代的异恶唑，仅存在一种区域异构体。基于H，C-HSQC和H，C-HMBC实验，完全分配1 H和13 C NMR光谱中的信号。通过NOE实验也实验证明了3,5-二取代，其通过H-4质子与来自3-和5-取代基的质子之间的空间相互作用表明。

生物活动

我们研究了3,5-二取代异恶唑6-11对植物组织中NO和活性氧（ROS）产生的电感效应。通常，NO和ROS，如O 2 -，OH·和H 2 O 2，一起需要诱导植物中各种防御相关酶的活化[55]。植物细胞含有氧自由基解毒酶和非酶抗氧化剂，它们在保护植物细胞免受ROS和NO生成位点的氧化损伤方面具有重要作用[56,57]。由于这些自由基的高反应性和极短的生理半衰期，测量植物组织中的ROS和NO水平通常是困难的[58,59]。

在这项工作中，通过荧光显微镜使用特定的荧光指示剂证明了NO和ROS的产生，这些指示剂有助于精确定义生成位点。我们使用拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型种子，在Arasystem的实验室中培养六周[60]。选择拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为NO 诱导物的模式生物，因为这是对细胞和分子生物学具有最大量知识的开花植物，并且其具有相对短的生命周期。向拟南芥叶中喷洒异恶唑诱导剂6-11的细悬浮液分别在两种不同浓度（分别为10μg/ mL和50μg/ mL）下收集并在24小时后收集。将收集的叶子用蒸馏水洗涤并与特异性荧光指示剂一起孵育，用于通过荧光显微镜对ROS和NO进行组织化学分析。未经处理的拟南芥叶用诱导剂悬浮液作为阴性对照。作为阳性对照，我们使用具有平均分子量的壳聚糖（β-1,4连接的葡糖胺），一种具有已知效果的真菌诱导子作为拟南芥的 NO和ROS诱导剂[61]。

使用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H 2 DCF DA）作为荧光指示剂观察细胞内ROS 。该方法基于2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯的非荧光探针氧化成高荧光的2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯[62,63]。

使用4-氨基-5-甲基氨基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DAF-FM二乙酸酯）（一种非荧光化合物）观察细胞内NO，其与NO反应形成荧光苯并三唑并且不与任何ROS反应[64-67]。

所有3,5-二取代的异恶唑的荧光显微图像-处理过的拟南芥叶子表明ROS中的电感器的两种浓度的显着存在（10微克/毫升和50微克/毫升）。观察到强荧光密度，特别是在较高浓度（50μg/ mL）的3,5-二取代异恶唑时。荧光强度揭示了测试化合物之间的差异。这些化合物可以按照ROS生成功效的递增顺序列出如下：11 > 10 > 9 > 7 > 8 > 6（支持信息文件1中的图S2 ）。

类似地，荧光显微镜的图像揭示NO的存在下，在所有3,5-二取代的异恶唑-处理过的拟南芥的叶子，在两种浓度（10微克/毫升和50微克/毫升），尤其是在化合物的较高浓度（50微克/毫升）。新合成的3,5-二取代异恶唑的NO释放能力遵循以下系列：9 > 11 > 10 > 8 > 7 = 6（支持信息文件1中的图S3 ）。

荧光数据表明3,5-二取代的异恶唑6-11，特别是9-11，参与拟南芥处理的叶中的NO和ROS产生。