二萜的生物合成和转移到异源生产系统

由于复杂的代谢相干性，将来自植物的生物合成基因簇整合到细菌宿主中通常不是微不足道的。在异源系统中成功生产二萜类碳水化合物骨架的关键步骤可分为以下三个方面：

1：中心类异戊二烯前体的形成，

2：C5构建嵌段与线性异戊二烯基二磷酸酯的结合

3：通过合酶的环化或缩合反应。

这些步骤中涉及的一般催化过程将在下一节中简要介绍。当描述细菌宿主的代谢工程时，将更详细地讨论不同途径的选定元件。

前体形成

所有萜烯均来自普遍存在的中心代谢产物异戊烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）[24]（见方案1）。有趣的是，只有两种代谢途径（MEP和MEV）已被鉴定用于结构高度多样化的类异戊二烯家族的多样化生物合成。两种途径均使用中枢糖代谢的中间产物作为碳源[25]。在大多数真核生物中（所有哺乳动物，酵母，真菌，古细菌和植物（更确切地说，在胞质溶胶和线粒体中））类异戊二烯前体通过甲羟戊酸途径（MVA）从乙酰辅酶A开始合成[26]。或者，在大多数真细菌，蓝细菌，绿藻和植物质体中，类异戊二烯生物合成来自甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸[26,27]。该途径的同名中间体是第二酶促步骤的产物，其中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）被还原成2- C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（参见方案1）。

高等植物中两种途径的平行发生通过区室化来调节[30]，其中二萜生物合成在质体中定位[31]。用于生产二萜的植物的代谢工程仍然具有挑战性，因为生物合成酶需要指向特定细胞器的方向[32]和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）的反馈抑制，这可以防止积累期望的铅结构[33]。

异戊二烯二磷酸酯的形成

在前体形成的下游，IPP和DMAPP与长链多聚丙烯基的缩合先于萜烯合酶分别代谢成线性或单环和多环产物[24]。这种标准序列的一个例外是异戊二烯等半萜类化合物，它们直接来自DMAPP [34]。

为了获得单 - （C10），倍半 - （C15），二 - （C20）萜烯和含有较大碳骨架的萜烯，IPP和DMAPP通过异戊二烯基二磷酸合成酶（IDS）连接在一起，这些都被Wang和Ohnuma [35]。根据其产物的长度和立体化学来区分异戊烯转移酶的成员[36,37]。

Z-异戊二烯二磷酸合成酶参与合成非常长链的聚戊烯醇，如天然橡胶[38]和相对较短的多萜醇链[39]。绝大多数萜烯，类固醇和其他类异戊二烯，如胆固醇和类胡萝卜素，均来自E -condensations [35]。

通过香叶基二磷酸合成酶（GPPS）将单个IPP和DMAPP头尾连接，得到香叶基二磷酸，GPP，所有单萜的通用前体[40]。随后通过法呢基二磷酸合成酶（FPPS）和香叶基香叶基二磷酸合成酶（GGPPS）将更多IPP单元顺式加成到香叶基二磷酸酯中，产生倍半萜（二十二烷基二磷酸酯，FPP）和二萜（ge牛儿基ge牛儿基二磷酸，GGPP）的前体[35]。。

萜烯合成酶

有趣的是，植物代谢可以将通用脂肪族二萜前体GGPP转化为数千种不同的萜烯结构，具有高度的结构复杂性和精细的功能性装饰[41]。虽然萜烯产物的结构多样性是通过萜烯环化酶[31]进行的环化和重排步骤的精确调节获得的，但是通过碳主链的羟基化与高度特异性的P450单加氧酶[42-44]引入初始官能团。

目前，萜烯合成酶（TPS）分为三组，主要包括α-螺旋结构，称为α-，β-和γ-结构域[45]。结构和催化多样性，尤其是植物萜烯合酶，起源于这些结构域的各种组合[46]。三组萜烯合成酶根据其内含子/外显子模式[47]及其不同的反应起始机制[48]进行分类。Trapp及其同事对植物萜烯合成酶的基因组分析[47]揭示了用于I类萜烯环化酶的12-14个内含子的一般组织，用于II类的9个内含子和用于III类环化酶的6个内含子。III类萜烯合酶似乎专门负责单，倍半萜和二萜结构的被子植物次级代谢产物，并含有高度保守的RR（x）8W-基序[47,49]。由I类酶进行的萜烯形成通过异戊二烯基二磷酸底物通过三价离子的二价金属离子簇来进行[48]。更具体地说，Mg 2+ - 或Mn 2+- 离子被两个保守的氨基酸序列结合，称为DDXX（XX）D / E（“富含天冬氨酸”）和NSE / DTE [（N，D）D（L ，I，V）X（S，T）XXXE]主题，分别为[48]。合成这些I类酶的第一个步骤是从异戊二烯基二磷酸底物[50]中提取二磷酸基团，假定二磷酸基团保留在酶的活性位点内[51,52]。II类萜烯合酶具有独特的DXDD基序[52]，环化通常是通过底物的末端碳双键质子化引发的[53]。由于二磷酸基团在基质活化期间通过这种类型的合成酶保存，因此来自II类TPS的产物可以作为I类TPS的底物，例如已经报道了在labdane-和clerodane型二萜的生物合成中[41]。。这种密切合作可以在一种单一的双功能酶中进行，包括两种类型的结构基序或两种不同类型的两种不同单功能合成酶[54,55]。

工程措施可直接针对萜烯合成酶的一级结构，或间接旨在通过分别改变三级或四级结构来改变或优化产物谱[23]。以下段落应概述突变工程，组合酶设计和微生物工程领域的当前发展。

萜烯合酶的突变工程

二萜环化酶的定点诱变通常用于阐明结构 - 功能关系，并且主要靶向酶的活性位点以改变底物配位腔的极性或尺寸。最近报道的来自短叶红豆杉（TXS）的I类紫杉二烯合成酶的靶向工程[51]使得能够新理解该酶在底物GGPP上进行的机械过程。淬灭自然导致三环紫杉二烯[56]形成的碳阳离子级联通过将584位的缬氨酸与甲硫氨酸交换来实现。所得产物被鉴定为轮枝菌素类型的双环二萜[51]（方案2）。位置753（W753H）中的单个残基开关可能导致在TXS的环化机制中使嵌段共聚物-15-基阳离子中间体过早去质子化，从而产生单环cembrene A [51]（方案2）。

因此，重编程二萜合酶的催化级联和随后在微生物宿主中酶变体的功能性表达不仅可以提供对环化机制的见解，而且还可以产生新产物或产物谱的变化。对于细菌二萜环辛酸-9-烯-7-醇合酶（CotB2）[57]也已经证实了这一点，也是推定的I类TPS。色氨酸288在CotB2成甘氨酸的突变导致（1的立体选择性合成[R，3 é，7 ê，11级小号，12 小号）-3,7,18-dolabellatriene，双环二萜（方案2）。Dollabellanes主要来自海洋生物，并显示出生物活性，如抗病毒和细胞毒作用[59]。来自重编程CotB2的Dolabellatriene对多药耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌活性有助于该家族的天然产物[57]。该酶的其他突变产生一种膜型单环（F107A）（方案2）和两种非天然的fusicoccane型二萜（F107Y和F149L）[57]。后者是植物毒性fusicoccin A [60]的新途径中推定的中间体，其衍生物具有可能的抗癌潜力[61]。

来自Horehound Marrubium vulgare（MvCPS1）的II类peregrinol二磷酸合成酶活性位点中的两个氨基酸残基的交换[58]导致labda-13-en-8-yl二磷酸酯碳阳离子中间体的中和机制发生改变。形成halima-5（10），13-二烯基二磷酸酯（方案2）。在野生型II类二萜合酶中，labda-13-en-8-yl二磷酸酯碳阳离子在去质子化之前经历单一去质子化或级联的氢化物和甲基基团移位，偶尔在碳水化合物中间体的C8位置水合，产生羟基化二磷酸盐产品[62]。然而，MvCPS1在水合作用之前催化C9-C8氢化物转变，产生用于抗糖尿病的marrubiin的labdane型二萜前体[63]。MvCPS1，W323L：F505Y和W323F：F505Y的双重突变完全改变了产品特异性，使其达到了迄今未鉴定的新型二甲烷二萜[58]（方案2）。