组合生物合成 - 制造萜烯的酶设计

常规鉴定涉及二萜生物合成途径的新酶活性需要耗时的基因组挖掘和高通量筛选技术[64,65]。另外，目前可用的，甚至部分注释的植物基因组和二萜合酶的晶体结构的数量仍然是有限的。然而，为了建立已知二萜的异源生产系统或获得新化合物，对该酶类结构信息的深入理解和可获得性是至关重要的。

在过去几年中，包含代谢组学和基于转录组学的方法的模块化方法为快速鉴定（二）萜烯开辟了新的途径。

Andersen-Ranberg及其同事最近报道了单官能I类/ II类二萜合酶组合的合成收集，这导致高剂量的立体选择性合成了大量以前未知或不可驯化的二萜类化合物，其中含有丁烷和clerodane型结构[66]。贾和他的同事[67]提供了其他研究结果，他们证明了植物和真菌I类二萜合酶的高底物杂乱性。该研究涉及二萜类环化酶的一般底物，如GGPP及其顺式异构体二萘嵌苯二磷酸酯（NNPP）[68]以及与植物II类二萜合酶的12种已知和可用产品的新组合。因此，他们所获得的半日花烷家族的13个以前未描述双萜除了先前所描述的二萜烯等manool [69] ，香紫苏醇[69]和顺 -abienol [64] 。

在Salvia divinorum [70]中进行的salvinorin A（一种潜在应用为神经精神药物和成瘾治疗的精神营养药物）的生物合成研究导致鉴定出五种新的I类和II类二萜合酶。此外，该研究采用组合方法进行体内基质杂乱试验[41,66]。所得产物含有pimarane-和abietane-型二萜以及反式 -十三烷二萜类型的双萜烷酮，这是salvinorin A生物合成中的推定中间体。

其他双功能二萜合酶不包含I类/ II类结构域的组合，但含有异戊二烯基转移酶结构域和萜烯合酶部分。催化模块的这种组合允许在单一生物催化剂中直接形成异戊二烯基二磷酸酯底物用于萜烯合酶。Chen及其同事[60]发表了这些双功能酶的一个不同寻常的例子，他们设法结晶了Patr的催化结构域，一种来自Phomopsis amygdali的二萜合成酶。。GGPP的形成位于C-末端α-结构域，与N-末端I类萜烯合酶结构域具有非常低的序列同一性，表明不同的催化性质。PaFS的天然产物是fusicocca-2,10（14）-diene，它是P. amygdali生物合成植物毒素fusicoccin A的中间体。有趣的是，秦和他的同事[71]最近的一项研究甚至揭示了通过交换异戊二烯基转移酶结构域将真菌二萜合酶转化为半萜合酶。

香紫苏醇，（13 -细菌生产宿主，香味化合物（+）的工业规模合成组合这些结构的见解和新创建的生物合成途径与功能性表达- [R ）- （+） - manoyl氧化物（前体为药用毛喉素），或miltiradiene（前体对于抗氧化剂和丹参酮）可能是可以达到的[66]。此外，二萜合酶的基因工程增强了结构 - 功能关系的知识，同时增加了新的潜在生物活性二萜的供应。

重新编程（植物）二萜合酶的催化活性也可以是广泛的基因组挖掘和筛选策略的替代方案，因为该技术可能潜在地接近或规避生物合成途径中的知识缺口，所述生物活性产物先前是不可接近的。一个很好的例子是细菌二萜合酶CotB2的诱变，导致了dolabellatriene型支架，这种支架当时主要存在于海洋生物中[59]。为此，这些新路线可以提供实质性和环保的替代品，从珊瑚等稀有资源中采购天然二萜[72]。

微生物工程

遗传易于获得的工程宿主大肠杆菌和酿酒酵母适用于异源萜烯生产。通过代谢数据库和计算工具[73]的可用性完成已建立的培养条件，这些工具可以实现基于模型的优化，例如通量平衡分析[74]。利用两种生物中不同类异戊二烯途径的自然存在和可操纵性（大肠杆菌中的 MEP 和酿酒酵母中的 MEV ），已经通过工业相关的生产滴度实现了几种类异戊二烯天然产物的异源生产[75-77]。。然而，目前对于一种微生物生产宿主没有明显的偏好，因为每项工程努力都需要针对特定萜类化合物产品进行从头基准测试，这表明即使极少引入异源基因用于萜烯生产也会导致不可预测的代谢反馈反应，目前只能被经验方法抵消。例如，单萜对微生物有毒性作用，但大肠杆菌似乎对α-pine烯或柠檬烯等产品更耐受[78]。

目前，27.4克/升的紫穗槐二烯是大肠杆菌中产生的任何报道的萜类化合物的最高公布滴度。该结果具有特别的工业相关性，因为紫穗槐二烯构成抗疟药青蒿素的倍半萜类支架[79]。相比之下，酿酒酵母中紫穗槐二烯的产量确实过量滴度为40 g / L [80]。

对于模拟二萜紫杉二烯，观察到紫穗槐二烯相反的结果，其中酿酒酵母中的异源生产导致8.7mg / L，而在大肠杆菌中 可以获得1g / L紫杉二烯的产量[28,81]。萜烯产物增加的不同方法涉及靶向MEP途径的特定元件[28]或从酵母中引入异源MEV途径[82,83]。Ajikumar及其同事通过过量表达内源性MEP途径的瓶颈酶（dxs，idi，ispD，ispF，方案1）在大肠杆菌中产生高水平的紫杉二烯。）与来自短叶红豆杉的 GGPP-合成酶（GGPPS）和紫杉二烯合成酶（TXS）一起[28]。Kong等人报道了重要的二萜中间体ent -kaurene（赤霉素生物合成的前体[84]）的产物滴度升高。[29]。该MEP-元素他们的策略涉及过表达DXS，IDI和ISPA（见方案1）在经工程改造的大肠杆菌菌株共表达重组ENT -copalyl二磷酸合酶（CPPS）和ENT从-kaurene合酶（KS）甜菊作为以及GGPPSRhodobacter sphaeroides。

随着越来越多的整合的重组酶平衡（过）表达增加重要性，以便维持生产宿主中从培养基进料到所需产物的最佳碳通量。在这方面，确定核糖体结合位点（RBS）的最佳强度可能与遗传元件在设计的操纵子上的正确排列同样重要[85-87]。为此，番茄红素报告系统代表了确定大肠杆菌 中萜烯中心异源途径平衡表达的有价值工具[88,89]。此外，大规模细菌二萜生产中的显着障碍是工程化萜烯合酶在异源宿主中的功能性表达。同样，烃支架的下游功能化，这是生物活性的先决条件[90]，在任何重组宿主中都存在挑战。在二萜的下游生物合成中完成的绝大多数修饰包括通过细胞色素-P450酶引入氧部分，其通常不是来自细菌系统。事实上，真核萜烯合酶或氧化还原酶的功能性重建需要显着的酶修饰。具体地，密码子优化和负责例如膜定位的不同结构域的截短可以改善酶活性。迄今为止，鉴定细菌宿主中可溶性表达的必需序列片段以及寻找P450酶的最佳氧化还原配偶体仍然是经验工作的问题[44,91,92]。此外，将每种额外的酶整合到生产系统中最终会导致最终产量的显着降低，这使得涉及多个氧化步骤的非常复杂的生物合成具有挑战性[93]。即使是高度优化的紫杉醇生物合成中第一个羟基化中间体生产系统，5-α-羟基琥珀二烯[91]，与之前报道的未修饰的紫杉二烯大环化合物相比，产品损失超过40％[28]。因此，单独设计一个宿主有时可能是不够的，因为生物合成途径的特定元素可能在一个生物体或另一个生物体中具有不同的生产能力。周等人。[94]报道了特异性工程化的大肠杆菌和酿酒酵母菌株的稳定共培养发酵，用于生产不同的倍半萜和二萜。尽管紫杉烷产品的最终产量是非常低的mg规模，但是可以实现脱氧单乙酰化紫杉二烯的首次微生物生产。

扩大的发酵过程的优化通常涉及碳源的选择，培养基组成和原位或后发酵产物的去除。一些萜烯产品对生产宿主具有细胞毒性作用，并且在发酵期间已经推荐从细胞中分离。Ajikumar等人。还报道了抑制性代谢物吲哚的过程积累[28]。用于大多数发酵的合适方法是用非极性烷烃如十二烷覆盖[28,79,95]，尽管从该相中提取后续产物可能具有挑战性并且氧化能力降低。工程外排转运蛋白增强细胞外产物分泌可能是这种非极性相捕获的可行支持[96]。然而，一旦进一步的工程步骤涉及产物骨架的极化，这些方法就不再适用。

在过去的几年中，无数的，在某些情况下，关于萜烯和异源萜烯生物合成的开创性研究已经发表，它似乎仍然只是冰山一角。潜在地，具有快速扩展数据库资源的模块化生物合成将扩大大规模生产的可接受目标，以达到无法预料的范围。作为先决条件，异源宿主的菌株优化必须以相同的进展发展，尽管连续报道了在大肠杆菌中形成类异戊二烯前体形成的天然途径。，环境保护部，证明其复杂性。涉及通量平衡分析的计算方法可以将优化系统的经验筛选重定向到指导工程，以克服代谢瓶颈并识别反馈抑制环。在具有中等产量的稳定系统中已经可以实现几种二萜的异源生产，验证了用于萜烯合酶的酶工程的既定方法。然而，这种成功不能完全转移到P450酶的异源表达。溶解度与底物和产物特异性一起仍是进一步工程的重要目标。