γ-氨基丁酸（GABA）转运蛋白1（GAT1）属于Na +和Cl -偶联转运蛋白家族，具有12个推定的跨膜结构域。为了执行GAT1蛋白质的结构分析中，GAT1 /绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白在昆虫中功能性表达的SF 9个细胞通过BAC-TO-BAC ®杆状病毒表达系统。已经建立了从昆虫Sf9细胞中纯化GAT1 / GFP融合蛋白的两步法，并涉及使用自制抗GFP抗体和尺寸排阻快速蛋白液相色谱（SE-FPLC）的免疫亲和层析。可以从400-600mL感染的细胞中纯化200-300μgGAT1/ GFP蛋白的产量Sf 9细胞。通过透射电子显微镜（TEM）分析纯化的蛋白质，其显示GAT1 / GFP融合蛋白以其单体形式分离。
关键词： 杆状病毒表达系统; 色谱; γ-氨基丁酸（GABA）; GABA转运蛋白1（GAT1）
γ-氨基丁酸（GABA）是脊椎动物物种中枢神经系统（CNS）中最丰富的抑制性神经递质。通过GABA转运蛋白（GAT）从突触间隙快速去除GABA，有效终止GABA能神经传递。GAT的活性对于控制GABA在突触间隙中的浓度和停留时间以及严格调节GABA受体的突触抑制是重要的[1]。GAT位于神经元和神经胶质细胞的质膜中，属于哺乳动物的溶质载体6（SLC6）家族，根据序列组成细分为四组：GATs，GABA，渗透压和肌酸转运蛋白，神经递质氨基酸酸，单胺和营养氨基酸/孤儿转运蛋白[2,3]。到目前为止，已经确定了四种GAT亚型（GAT1-4）[4]。
GAT1是第一个被克隆的神经递质转运蛋白，在大鼠，小鼠和人类CNS中大量但限制性地表达[4-8]。GAT1的跨膜（TM）拓扑学证明该单一多肽含有12个通过亲水环连接的TM结构域，其氨基和羧基末端位于细胞质中[9,10]。此外，GAT1蛋白含有三个保守的N-糖基化位点[9]。N-连接聚糖在GAT1 GABA摄取活性中的作用已被广泛阐明[11,12]。GAT1的拓扑模型与LeuT Aa的高分辨率晶体结构一致，来自细菌Aquifexaeolicus 的SLC /神经递质钠同向转运体（NSS）转运蛋白的同源物[13]。LeuT Aa结构为GAT1和其他SLC6成员的研究提供了良好的模型[3]。GAT的活动是由Na +和Cl -离子的电化学梯度驱动的[14]，并且在LeuT Aa的晶体结构中已经清楚地记录了底物和两个钠离子的结合袋。通过确定氯离子结合的关键结构元素，阐明了氯离子的依赖性[15,16]。此外，基于来自不同家族的钠同种异体的几种晶体结构，观察到类似的核心结构; 这一观察结果强烈支持交替进入机制作为GAT1蛋白的共同转运机制[13,17-20]。
由于GABA能系统与许多神经系统疾病[21-24]有关，因此GABA活性的调节具有相当大的医学意义[25,26]，并且主要的GABA能神经末梢蛋白GAT1是潜在的药物靶标。GAT1蛋白的确切三维结构可为药物研究提供更多信息。
大多数膜蛋白的结构分析具有挑战性，因为需要显着的蛋白质产量，并且因为真核膜蛋白在表达和纯化过程中应该处于天然和功能构象。大多数膜蛋白的天然丰度通常不足以分离足够量的功能和结构研究。在这项工作中，选择杆状病毒表达系统用于GAT1蛋白表达。使用质谱法，凝胶电泳和GABA摄取测定法在表达和纯化过程中表征产物。在我们的工作中，GAT1蛋白在其C末端具有绿色荧光蛋白（GFP）标签，其不影响GAT1的相关功能[27]，可以以功能形式纯化。此外，GFP标签具有进一步工作的几个优点。例如，它提供了一种强有力的方法，用于已经产生的特异性抗GFP抗体的亲和纯化，产生绿色荧光，用于有效观察目的蛋白质的表达，并具有已知的晶体结构[28,29]用于未来的结构研究。