GAT1 / GFP融合蛋白在昆虫细胞中的表达和鉴定

GAT1 / GFP重组杆状病毒的构建与分析

用于结构研究的目的蛋白质的纯化需要来自异源过表达的丰富蛋白质来源。在我们的工作中，由于其12个TM结构域和N-糖基化状态，大肠杆菌不是用于表达GAT1 / GFP重组蛋白的合适系统。经过30年的发展，杆状病毒表达系统已成为一种广泛应用的重组蛋白生产技术[30,31]。由于产生足够量的同源蛋白质是限速步骤，因此在本研究中，我们选择杆状病毒表达系统用于GAT1蛋白质表达而不是哺乳动物细胞表达系统。

将GAT1 / GFP重组cDNA克隆到pFastBac1载体中（图S1A，支持信息文件1），并在杆状病毒表达系统的杆粒中制备（图S1B，支持信息文件1）。通过病毒感染在Sf 9细胞中表达GAT1 / GFP重组蛋白72小时。进一步表征GAT1 / GFP蛋白的表达。感染后72小时，通过流式细胞术控制具有绿色荧光的Sf 9细胞（图1A）并通过荧光显微镜分析（图1B））。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE进一步测定GAT1 / GFP在昆虫细胞中的表达，然后用抗GFP pAb（图1C）或抗GAT1 pAb（图1D）和银染色进行Western印迹（图1E）用抗GFP mAb免疫沉淀后（显示约50kDa的条带）。在感染的Sf 9细胞中，GAT1 / GFP-融合蛋白在SDS-PAGE中显示两条主要条带（7.5％）（由箭头指示），并且单体形式表现为约75kDa的主条带。该条带只能与Galanthusnivalis凝集素（GNA，地高辛配基凝集素）强烈结合（图1F）），表明在昆虫细胞中paucimannose结构的优势。相反，哺乳动物N-聚糖具有末端唾液酸残基，具有更多的触角多样性。约250kDa的条带对应于通过进一步表征鉴定的寡聚形式或蛋白质聚集体。

免疫沉淀后的两个主要蛋白质条带和用考马斯蓝染色的SDS-PAGE（图2A中的 a和b ）被提取用于蛋白质指纹分析。通过胰蛋白酶处理处理提取的蛋白质，并且通过基质辅助激光解吸/电离 - 飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）或胍基化直接分析胰蛋白酶肽，然后通过MALDI分析。通过将来自一级序列数据库的肽与Mascot（http://www.matrixscience.com/）匹配，将质谱中标记的肽峰（图2B）鉴定为GAT或GFP 。

在昆虫细胞中表达的哺乳动物来源的重组蛋白的生物学功能可以通过不同的N-葡聚糖状态改变。我们观察到末端唾液酸残基对于GAT1的GABA摄取活性是必需的，因为它们影响Na +的离子亲和力和GAT1蛋白在其摄取过程中的构象变化[12]。后72小时后感染，的GABA摄取活性SF 9细胞中测量，以确定是否GAT1 / GFP融合蛋白是在杆状病毒表达系统中功能性表达。结果显示感染的Sf 9细胞（0.15 pmol / 10 6细胞）仅具有比模拟细胞略高的GABA摄取活性（0.1pmol / 10 6细胞）（图S3，支持信息文件1）。之前的研究表明，共转化N-糖基化而不是N-聚糖的末端修饰参与正确的膜糖蛋白折叠的调节，因为1-脱氧甘露聚霉素（dMM）对N-糖基化加工的抑制导致甘露糖富含类型的N-聚糖，不影响蛋白质稳定性或细胞内运输[11]。因此，GAT1 / GFP蛋白在昆虫细胞中的正确折叠不应受到缺乏末端修剪的影响，包括N-聚糖的唾液酸化。GAT1 / GFP融合蛋白在昆虫细胞中的低GABA摄取活性应该由N-聚糖上的末端甘露糖结构产生，这与先前的发现一致[12]。因此，杆状病毒系统中产生的GAT1 / GFP蛋白可适用于进一步的结构分析，具有正确的折叠和更均匀，更简单的N-葡聚糖。