fusaricidin分离和结构解析

在类芽孢杆菌在含有GYM培养基（10g / L葡萄糖，4g / L酵母提取物，10g / L麦芽提取物; pH5.5，高压灭菌前调节）和20g / L琼脂的琼脂平板上培养菌株。浸没培养在室温下进行10至20天。为了维护，使用含有相同培养基的琼脂斜面并在4℃下储存。用4-5个生长良好的琼脂培养物接种小规模液体培养物（500mL烧瓶中的250mL GYM培养基），并在轨道振荡器上以120rpm在室温下培养。在20L发酵罐中进行大规模发酵，其中15L GYM培养基在室温下接种250mL充分生长的液体培养物，同时搅拌（120rpm）和通气（3L / min）5至8天。为了防止过度发泡，在灭菌介质之前加入几毫升硅氧烷消泡剂。

向培养物中加入等体积的异丙醇。搅拌2小时后，向混合物中加入200g / L氯化钠，直至可见有机相和水相的相分离。将异丙醇层真空浓缩。将所得提取物溶解在甲醇中，离心以更好地沉淀盐残余物，并将有机相再次真空浓缩。重复该步骤直至看不到进一步的盐沉淀。

将一部分提取物（30g）溶解在甲醇中并吸附到硅胶（Merck，K60,70-230目，50g）上，在40℃下干燥并施加到硅胶上（1kg，柱直径10cm） ，30厘米高）。洗脱分四步进行如下：乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇（3：1，v / v），乙酸乙酯/甲醇（1：1，v / v）和甲醇。将含有活性化合物的第三部分真空干燥，并溶于40％甲醇（MeOH）的0.1％甲酸（FA，浓度：100mg / mL）中。丢弃其他部分。将一部分（20mL）样品上样到预先平衡的（含有40％MeOH的0.1％FA）Chromabond HR-X柱（Macherey-Nagel，1000mg）中。将柱用100mL 40％MeOH的0.1％FA洗涤，并用60mL 70％MeOH的0.1％FA溶液洗脱。将样品溶解在DMSO中（浓度：将200mg / mL）和300μL应用于Sunfire C18柱（19×250mm，5μm，Waters）并如下洗脱：以10mL / min洗脱16分钟，等度70％0.2％FA; 30％乙腈（MeCN），14mL / min，1分钟，梯度至65％0.2％FA; 35％MeCN，14mL / min，5分钟，等度65％，0.2％FA; 35％MeCN。将得到的五个级分真空干燥并重新溶解在DMSO中（浓度：125mg / mL）。使用相同的柱进行进一步纯化，并对每个级分（每次运行12.5mg）调节等度条件（流速：10.5mL / min）。在第二部分中68％0.2％FA; 使用32％MeCN并检测到单峰，由两种新型镰孢菌素的不可分离的混合物组成，其被命名为fusaricidin E（等度70％0.2％FA; 30％乙腈（MeCN），14mL / min，1分钟，梯度至65％0.2％FA; 35％MeCN，14mL / min，5分钟，等度65％，0.2％FA; 35％MeCN。将得到的五个级分真空干燥并重新溶解在DMSO中（浓度：125mg / mL）。使用相同的柱进行进一步纯化，并对每个级分（每次运行12.5mg）调节等度条件（流速：10.5mL / min）。在第二部分中68％0.2％FA; 使用32％MeCN并检测到单峰，由两种新型镰孢菌素的不可分离的混合物组成，其被命名为fusaricidin E（等度70％0.2％FA; 30％乙腈（MeCN），14mL / min，1分钟，梯度至65％0.2％FA; 35％MeCN，14mL / min，5分钟，等度65％，0.2％FA; 35％MeCN。将得到的五个级分真空干燥并重新溶解在DMSO中（浓度：125mg / mL）。使用相同的柱进行进一步纯化，并对每个级分（每次运行12.5mg）调节等度条件（流速：10.5mL / min）。在第二部分中68％0.2％FA; 使用32％MeCN并检测到单峰，由两种新型镰孢菌素的不可分离的混合物组成，其被命名为fusaricidin E（使用相同的柱进行进一步纯化，并对每个级分（每次运行12.5mg）调节等度条件（流速：10.5mL / min）。在第二部分中68％0.2％FA; 使用32％MeCN并检测到单峰，由两种新型镰孢菌素的不可分离的混合物组成，其被命名为fusaricidin E（使用相同的柱进行进一步纯化，并对每个级分（每次运行12.5mg）调节等度条件（流速：10.5mL / min）。在第二部分中68％0.2％FA; 使用32％MeCN并检测到单峰，由两种新型镰孢菌素的不可分离的混合物组成，其被命名为fusaricidin E（1）和fusaricidin F（2）。混合物（6.0mg）由3份2和7份高级同系物1组成，旋光度为[α] D 25 +20.9（c 0.6，DMSO- d 6）。两种代谢物之间的质量差异为14 amu。该观察结果由在ESIMS光谱中在m / z 961.6和m / z 975.6 处观察到的两个离子峰支持。

通过对主要组分1的1和2D NMR数据的广泛分析，鉴定了包括酪氨酸（Tyr），谷氨酰胺（Gln），丙氨酸（Ala），两种苏氨酸（Thr1和Thr2）和异亮氨酸（Ile）的六种氨基酸。COZY，NOESY和HMBC等核磁共振实验（图2）通过两个或三个键相关性阐明了氨基酸的序列。