分享一篇2024年发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目是“Tyrosinase-Based Proximity Labeling in Living Cells and In Vivo”。文章的通讯作者是日本京都大学的Itaru Hamachi教授。
邻近标记(PL)是一种新兴的方法，能够在生命系统改善空间蛋白质组学，其定义是酶或光催化剂对邻近生物分子的空间有限的混杂标记。然后用富集手柄标记的蛋白质通过质谱分离和鉴定，这揭示了催化剂锚定的环境。PL能够在各种细胞类型和物种中广泛表征亚细胞结构和蛋白质网络。酪氨酸酶是一种3型铜酶，它结合分子氧将苯酚或儿茶酚氧化为相应的邻醌，邻醌是一种活性亲电试剂，可以很容易地与可用的蛋白质亲核试剂结合。作者报道了一种酪氨酸酶作为一种新的PL酶(图1)，适用于活细胞和体内的无H2O2、快速和低背景的蛋白质标记。该PL方法包括来自巨型芽孢杆菌(BmTyr)的小(~ 35 kDa)细菌酪氨酸酶和各种专门用于富集和成像的苯酚探针(探针1 - 5)。BmTyr可以通过与相应的亲和配体偶联而被遗传编码或锚定在POI上。基于BmTyr的PL能够在活细胞中实现清晰的亚细胞分辨率，并在小鼠大脑的常驻突触中识别神经递质受体的邻近蛋白质。
图1. 基于BmTyr的PL. POI:感兴趣蛋白的示意图。探针1和探针2:体外表征。探针3:活细胞内标记(荧光成像)。探针4:细胞表面和体内标记，体内蛋白质组学。探针5:活细胞中的蛋白质组学。
体外BmTyr催化蛋白标记的表征
探针1和2，分别携带香豆素染料和荧光素染料，用于体外实验。BmTyr在BL21 (DE3)大肠杆菌中重组表达并纯化。首先，通过高效液相色谱法证实了BmTyr生成的邻醌对Cys、Lys和His的反应性(图2a)。这与先前BmTyr催化的蛋白生物偶联的结果一致。体外蛋白标记显示，在探针1和BmTyr孵育1分钟后，牛血清白蛋白(BSA)立即被标记(图2b)。对标记的牛血清白蛋白进行色氨酸消化，然后进行LC-MS/MS分析，鉴定出三个赖氨酸残基和四个肽段中的一个His残基被探针1修饰，其中包括探针1衍生的片段离子(图2c,d)。这些结果表明，BmTyr可以在温和条件下快速标记蛋白质。
图2. 体外BmTyr催化蛋白标记的表征。
活细胞亚细胞分辨PL和蛋白质组学。
接下来，作者试图使用基因编码的BmTyr和细胞渗透探针3将BmTyr应用于活HEK293T细胞的PL(图3a)。当探针3加入到表达BmTyr的细胞中时，检测到最小的蛋白标记，这表明BmTyr可能主要以载脂蛋白形式存在。在HBS21中添加生理水平的CuCl21小时激活BmTyr，用5 μM 的探针3获得显著的蛋白标记(图3b)。忽略BmTyr、CuCl2或探针3的阴性对照没有引发蛋白标记(图3b)。这一观察结果突出了BmTyr在低背景标记方面优于TurboID的优势。活细胞中的标记带在1分钟就可以检测到，10分钟后可以清晰地观察到(图3c)。这种检测过程比BioID更快，后者需要数小时才能进行有效的细胞生物素化。此外，聚焦于探针3的荧光素染料的CLSM成像证实了核选择性蛋白标记(图3d)。在细胞核中观察到，探针3孵育10分钟后，在线粒体和内质网内获得了特异性的蛋白质标记(图3d)。这些结果表明，BmTyr在不同的细胞环境中具有遗传可编码性，并允许快速和亚细胞分解的蛋白质标记。作者使用探针5进行了进一步的MS-based深度蛋白质组学分析，探针5具有去硫代生物素处理，方便了标记蛋白的富集。在表达Nu-BmTyr的HEK293T细胞中，用探针5标记10分钟后，标记的蛋白被中性蛋白珠富集，并被胰蛋白酶凝胶消化(图3e)。采用无标记定量法(LFQ)进行定量分析，与未转染BmTyr的样品相比，产生了645个蛋白质组(图3f)。这种压倒性的细胞核特异性与使用BioID和TurboID获得的结果相似鉴定出7个核心组蛋白，包括H2BC11，这是BmTyr的诱饵。Nu-BmTyr蛋白组中前70个染色体蛋白命中的蛋白相互作用图谱在H2BC11周围形成了一个主要的相互作用网络(图3g)，显示了PL的关键特征。
图3. 活细胞亚细胞分解PL和蛋白质组学。
配体系缚BmTyr的体内PL
最后，BmTyr的低毒性和快速PL促使作者将其应用于活体小鼠脑内，这是APEX等过氧化物酶基PL酶无法达到的。对于围绕特定神经递质受体的PL，设计了两个配体拴系的BmTyr, FITM-BmTyr和NAPS-BmTyr，分别将BmTyr锚定在代谢性谷氨酸受体1 (Grm1)和多巴胺受体D2 (Drd2)上(图4a)。将合成的具有马来酰亚胺柄的配体FITM-Alx647Mal和NAPS-Alx647-Mal与Cys-BmTyr偶联，得到单价配体系链BmTyr的清洁产物(图4b-e)。
图4. 配体系链BmTyr的制备。
作者首先证实了FITM-BmTyr和Nap-BmTyr分别在表达Grm1和Drd2的HEK293T细胞上与其靶受体的结合能力，而LFBmTyr则表现出最小的结合信号(图4f,g)。然后将它们直接注射到活体小鼠大脑的侧脑室(LV)，通过脑脊液的流动扩散，材料可以分布在整个大脑26(图5a)。PFA灌注固定后，分离小鼠脑并切片。CLSM成像显示，FITM-BmTyr选择性结合在小脑分子层(图5b,c)，内源性Grm1在小脑分子层高表达。这些图像与抗Grm1抗体染色的图像融合得很好。此外，成像数据显示NAPS-BmTyr特异性结合纹状体中的Drd2(图5d)。相比之下，LF-BmTyr在小脑和纹状体区域表现出微弱的信号。在体内，将探针4注入小脑(用于Grm1)或纹状体(用于Drd2)，锚定配体系固的BmTyr(图5a)。探针4标记的蛋白通过抗alx647抗体免疫沉淀富集，并以LF-BmTyr作为对照进行定量蛋白质组学分析(图5e)。FITM-BmTyr的PL生成了27个蛋白的蛋白质组，其中明确检测到Grm1(图5f)。氧化石墨烯富集分析发现细胞外周、质膜和突触蛋白显著富集(图5g)。具体来说，突触蛋白可以被分配到谷氨酸能突触，平行纤维可以分配到浦肯野细胞(PF−PC)突触。这一观察结果与Grm1的小脑定位一致，Grm1分布在小脑pc的突触后膜上，并在PF刺激下调节其突触传递检测到几种已知的PF−PC突触蛋白，特别是那些在物理上或功能上与Grm1相关的蛋白，如Grid2和Gabbr2(图5f,h)。这些结果表明，使用配体拴系BmTyr的PL在活体小鼠大脑中可以很好地绘制目标神经递质受体周围的蛋白质组。
图5. 配体系缚BmTyr在小鼠脑内的活体PL。
本文作者介绍了BmTyr作为一种新的PL酶，满足活细胞和体内对无H2O2、快速、低背景PL的需求。BmTyr与过氧化物酶和生物素连接酶具有不同的酶机制，其具有铜活性中心，利用分子氧而不是有毒的H2O2将苯酚氧化成邻醌。生成的醌可以广泛(Cys, Lys和His)和快速(在活细胞中≤10分钟)修饰周围蛋白质。使用BmTyr分别在活细胞和体内鉴定了细胞器分辨和突触分辨的PL。BmTyr相对较浅且暴露的活性中心使其对探针变化具有较高的耐受性，从而允许根据实验设计定制探针，例如荧光成像，蛋白质组学富集，以及细胞通透性和组织穿透性调节。作者设计了一种用于体内PL的配体系链BmTyr策略，其中BmTyr与一个小分子配体结合，可以将BmTyr固定在内源性POI上。体内PL后的蛋白质组学鉴定了活鼠脑中神经递质受体(Grm1和Drd2)在其常驻突触中的邻近蛋白。通过使用一系列亲和标签，例如抗体或适当的定位信号，这种策略可以很容易地扩展到各种蛋白质和感兴趣的区域。因此，各种Nb-BmTyrs有望成为活体脑PL的通用工具。
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