中国科学院化学研究所王德先课题组基于其在阴离子-π作用研究方面的积累和在人工阴离子通道方面的探索，提出了将分子沙漏和阴离子-π作用相结合的概念，用以模拟天然氯离子通道蛋白(ClC)的选择性孔道的形状和功能。此概念已经在其课题组最近所报道的研究工作中得到了实验上的验证。

氯离子是生命体系中主要的可渗透阴离子，其跨膜传输承载着重要的生理功能，并与诸多疾病密切相关。氯离子的跨膜传输借助相应的通道蛋白得以实现，氯离子通道蛋白（ClC）为其中最大的家族。已有的X-射线单晶结构表明，ClC蛋白的选择性传输孔道呈现沙漏型，中间狭窄区域为选择性过滤器，是决定氯离子通道具有高的Cl⁻/K⁺选择性、离子传导与门控耦合性以及pH依赖性传导等特性的关键。受天然氯离子通道的结构和功能启发，人工氯离子通道的研究一直是非常具有吸引力的研究课题。具有明确分子结构的人工氯离子通道能够提供简单的分子模型以方便建立结构和功能的关系、帮助人们深入认识天然氯离子通道的机理以及探索其在生物应用和疾病诊疗方面的应用。然而受阴离子独特性质的限制，阴离子的选择性传输并不容易实现。已有的报道重点在于提供离子传输通路的分子骨架（组装体）的设计以及氯离子跨膜传输的驱动力方面的考量。

本文作者所在课题组从事新型非共价阴离子-π作用研究，他们以缺电性的四氧杂杯[2]芳烃[2]三嗪为分子工具，为阴离子-π作用提供了实验证据并揭示了其普遍性、加深了对阴离子-π作用本质和规律的认识。与其它非共价相互作用相比较，阴离子-π作用的特点在于1）缺电性π面具有部分正电性并可为阴离子提供大的接触面；2）作为一种弱的非共价作用力可促进快速的离子结合与解离平衡，因而有利于离子沿缺电性平面的快速滑动。上述特征使得阴离子-π作用不失为一种理想的氯离子传输的驱动力。鉴于四氧杂杯[2]芳烃[2]三嗪独特的1，3-交替构象结构、结合阴离子的能力和易衍生化等特点，以及课题组对阴离子-π作用的认识，本文作者提出了以分子沙漏与阴离子-π作用结合的概念用来设计人工单分子通道，以此模拟ClC选择性孔道的形状和功能。

作者所设计的分子沙漏包括选择性控制中心、接力和头基三个部分，其中1）四氧杂杯[2]芳烃[2]三嗪为分子沙漏的中心骨架；2）分别在苯环和三嗪上沿通过共价键引入缺电性酰亚胺作为分子沙漏的侧臂，以保障侧臂的缺电性和整个分子具备跨越双层膜的长度；3）在侧臂的末端引入L-苯丙氨酸作为与磷脂头基相互作用的位点以帮助分子沙漏实现跨膜，分子沙漏的中心大环、侧臂上缺电子的酰亚胺片段构成了阴离子-π相互作用的位点（S_ext, S_cent, S_int）。基于此设计，作者发展了高效的“一锅法”合成方法，顺利得到了目标通道分子1（图1）。囊泡荧光实验证实了该通道分子具有高的氯离子传输活性，EC₅₀值为 1.50 μM。平面脂双层实验揭示了氯离子的单分子通道传输机制，根据线性的I/V关系获得了通道传输电导为20.8 pS。进一步的研究表明，该分子通道具有中等的Cl⁻/K⁺选择性和高的Cl^-/Br^-选择性，渗透性比率P_Cl-/P_K+和P_Cl-/P_Br-分别为1.90和22.83。作者提出了氯离子在分子沙漏所提供的孔道中通过阴离子-π作用和大环空腔效应进行脱水、传输和选择性控制的过程。

天然氯离子通道具有高的氯离子选择性和pH响应性，为了模拟其功能，作者在分子沙漏1的基础上，将其核心骨架四氧杂杯[2]芳烃[2]三嗪中的“惰性”的苯环替换为“活性”的苯酚基元，合成了含有仿ClC过滤器的分子沙漏2。基于荧光分析的囊泡技术表明分子沙漏2的EC₅₀值介于 0.10 ~ 0.14 μM之间，较先前的分子沙漏1活性增加了一个数量级。平面脂双层电导测量技术证实其通道电导为13.7 pS。通过预先在平面脂双层两侧设置KCl以及Cl^-/Br^-浓度梯度，发现通道分子2的P_Cl-/P_K+和P_Cl-/P_Br-渗透比分别提高到了4.17和66.21。进一步利用平面脂双层电导测量实验考察了通道分子离子传输的pH响应性，发现当缓冲溶液的pH值降低时，通道分子的Cl⁻/K⁺选择性可提升至可与天然ClC相媲美的P_Cl-/P_K+ = 12.31。作者认为分子沙漏的氨基酸端基在不同pH值的电荷状态是导致其具有pH响应性电导与选择性的原因。

作为分子沙漏结构的重要组成部分，侧臂的电子特性是否会对氯离子传输的选择性产生影响？针对这一问题，作者将缺电性的酰亚胺基元替换成富电性的芳环单元，设计合成了分子沙漏3（图3）。通过核磁滴定，作者发现分子沙漏3具有同时结合氯离子和钾离子的能力，且对氯离子的亲和力要高于钾离子。平面脂双层电导测量实验表明电流和电压之间呈现线性关系，斜率电导为18.9 pS，与通道分子1类似，表明电导率的大小主要由中心的大环空腔所决定。随后，利用非对称KCl溶液中的平面脂双层实验评估了通道分子3对Cl⁻或K⁺的选择性，发现通道分子3的阴/阳离子渗透性比率P_Cl-/P_K+ 为0.54，表明对钾离子的选择性优于对氯离子的选择性，即分子3是弱的阳离子选择性通道。作者认为分子沙漏侧臂的缺电性对阴离子的选择性发挥着不可忽视的作用。

本文证实分子沙漏和阴离子-π作用结合的概念能够模拟天然ClC选择性孔道的形状和选择性，其中分子沙漏缺电性的大环空腔起到了氯离子选择性过滤器的作用，缺电性的分子沙漏侧臂和氨基酸端基亦能影响或调控氯离子的选择性。本文所提出概念可为阴离子的选择性传输提供新的思路，亦可以拓展到自然界中其它的氯离子传输蛋白如囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)或阳离子辅助的氯离子传输蛋白（CCCs）的功能模拟。通过理性的分子设计和改造，有望获得性能优异的通道分子并展示其在生物应用和疾病诊疗方面的应用。