介绍一篇发表在Nature上的文章，文章标题“Complete computational design of high-efficiency Kemp elimination enzymes”，文章的通讯作者是来自魏茨曼研究所的Sarel J. Fleishman，其课题组主要从事蛋白质计算设计方面的研究。

酶的计算设计是计算生物学的圣杯。目前计算设计得到的酶普遍需要大量的实验优化方可得到与天然酶类似的活性水平。这暴露出计算方法对生物催化理解上的不足。本文中，作者开发了一套基于物理的计算设计流程，并将其成功应用于催化Kemp消除反应（KE）的酶的设计当中。作者开发的计算流程无需经过突变文库筛选优化，并最终得到高热稳定性（大于85℃）和高催化活性的酶。

设计流程包含以下几个部分。第一步为模块化骨架组装，作者选择IGPS酶作为初始输入；此酶家族在空间上可以容纳5-硝基苯并异噁唑底物，且此前被用于设计Kemp消除酶。作者通过组合片段的方法生成新的TIM桶折叠骨架。第二步，稳定性设计：设计结果显示在活性位点区域存在多种骨架可能性。第三步，几何匹配：作者将KE theozyme匹配至设计的结构中，并使用Rosetta优化活性位点。这一步产生了数百万种设计。作者设计了一个目标函数，综合考虑系统能量最小化、催化碱基去溶剂化最大化等目标，并最终挑选排名靠前的设计结果。第四步，稳定蛋白质核心以及优化活性位点。第五步，实验筛选。挑选了73个设计进行实验，其中得到3种具有KE活性的蛋白。第六步，使用FuncLib方法进一步优化活性位点。这一步中，作者移除同源序列限制，仅用原子能量函数优化活性位点。

第六步，将Des27改造为Des27.7，包含7个突变，最终的kcat/Km达到约12700 M-1s-1，设计结果与晶体结果也高度接近。

最后，作者通过类似“消融实验”的方法评估了各个设计环节的贡献。其中有趣的是，引入F113L显著提升了催化活性，这挑战了二十年来Kemp消除酶设计中“芳香族残基对配体结合很重要”的假设。这某种程度上表明了我们对生物催化的理解缺陷以及这其中潜在的优化空间。

本文作者：ZF

责任编辑：LYC

DOI：10.1038/s41586-025-09136-2

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-09136-2