分享一篇发表在Angewandte Chemie上的文章，题目为“Transsulfurase-Catalyzed Reversible Modification of C-Terminal Cysteine and Application for Orthogonal Dual Labeling of Proteins”，通讯作者是来自南开大学的潘彬彬博士，以及苏循成教授，苏循成教授研究方向是蛋白质定点标记方法的开发及细胞内磁共振研究的顺磁探针的开发。

代谢物衍生的蛋白质修饰代表了一种多样化且复杂的调控机制，细胞中不同类型蛋白质修饰的丰度和特异性部分受代谢物浓度、酶水平和选择性以及细胞类型等许多方面控制。生物条件的变化可能会显着影响特定代谢物的产生或积累，以及酶的活性和转录水平，进而最终影响蛋白质修饰。本文就报道了，作者意外发现在含有200 mM磷酸盐的M9+培养基中培养的大肠杆菌细胞中过度表达泛素突变体（Ub G76C）时，其C端被修饰，作者后续研究了该修饰，证明CGS和CGL这两种不同的酶分别调节其修饰的写入和去除，这将为半胱氨酸的区域选择性和正交双重标记提供巨大的潜力。

具体来说，作者首先在利用M9+培养基获得同位素富集的蛋白质的实验中，发现在200 mM磷酸盐的M9+培养基中的Ub G76C比LB培养基中的质量增加了101.2Da，此外富集15N同位素的Ub G76C的修饰质量为102.3Da，证明其中有一个氮原子。作者继续通过15N-HSQC 光谱表明修饰位点集中在蛋白C端的Cys上。相对于LB培养基来说，M9+培养基中没有各种氨基酸，细菌需要上调水平的氨基酸合成的相关酶才能生长，作者认为该修饰与氨基酸合成相关酶有关。所以作者在M9+培养基补充不同氨基酸，发现补充蛋氨酸会导致该修饰完全消失。于是作者在蛋氨酸合成途径中发现了胱硫氨酸γ合酶（CGS），其催化反应前后质量差与101.2吻合，于是作者就进行验证证明了其确实是负责该修饰写入的酶。

作者后续进行了机制的研究，发现CGS催化蛋白C端半胱氨酸的修饰具有卓越的特异性和单向催化活性。同时作者发现胱硫黄氨酸γ裂解酶（CGL）可以选择性裂解该修饰。为了确定CGS和CGL是否可以催化大范围蛋白质中C端半胱氨酸的可逆修饰，作者将LRLRGC标签融合到10种不同蛋白质的C端，证明在大多数蛋白中，CGS和CGL都可以高效催化其修饰的写入和去除。最后，作者还使用该策略尝试对蛋白质进行正交双标记，成功使用Ub K11C / G76C-acpγS 作为模型，首先在第一步使用荧光团标记 Cys11，然后CGL处理去除末端Cys的保护，再使用另一个荧光团进行末端Cys的标记。

总之，本文报告了蛋白质中 C 端半胱氨酸残基的可逆修饰反应的发现，由 CGS 和 CGL 特异性介导。这种双标记方法显着扩展了蛋白质硫醇生物偶联的范围，并在蛋白质和肽修饰方面具有巨大潜力。

本文作者：YDP

责任编辑：LYC

DOI：10.1002/anie.202507661

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202507661