一、PSD-95的分子结构及功能

PSD-95是突触后膜胞质面上由微丝和颗粒等致密物质构成的细胞骨架网格状蛋白，包含细胞骨架蛋白、细胞黏附蛋白，在神经元突触的形成和成熟中具有重要作用^[4]。

PSD-95有724个氨基酸，是膜相关的鸟苷酸激酶家族的成员之一，与该家族的其他蛋白相同，PSD-95的基本结构包括3个PDZ结构域(PDZ1、PDZ2、PDZ3)、一个SH3结构域及一个由无序链接区域连接的鸟苷酸激酶域，这些结构域被划分为两个独立的结构：PDZ1-PDZ2和PDZ3-SH3-鸟苷酸激酶域^[5,6]。与之直接和间接结合的蛋白包括神经连接蛋白、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)和钾通道蛋白^[4,7]，其中NMDAR和AMPAR是兴奋性谷氨酸能神经元的突触后膜受体，通过与它们的相互作用，PSD-95能够调节突触后致密斑的结构^[8]。

PSD-95主要存在于成熟的兴奋性谷氨酸能突触内，为突触后膜上的受体活动和稳定性所必需，并且在突触可塑性及发育期起着稳定的关键作用^[9]。与此同时，PSD-95还参与调控兴奋性突触和抑制性突触的动态平衡^[10]。在培养的海马神经元中，PSD-95的超表达加快了兴奋性突触的发育，选择性地增强了AMPAR的聚集^[11]。此外，Migaud等^[12]利用PSD-95基因突变小鼠，发现PSD-95基因定向破坏会导致突触可塑性的严重异常，包括长时程增强效应的放大和长时程抑制效应的破坏，结果证实PSD-95基因突变小鼠出现突触可塑性异常并且表现出空间学习障碍。

二、蛋白质的棕榈酰化修饰

蛋白质棕榈酰化修饰形式在40年前被发现，且广泛存在于神经系统中，蛋白质棕榈酰化在神经系统的发生率高于其他组织器官。多数含有半胱氨酸的神经元蛋白易受到棕榈酸的影响，如神经递质受体、突触支架蛋白和分泌信号分子等。O’Brien和Zata^[13]最早发现第一个含有共价附着棕榈酸的神经蛋白是视紫红蛋白。除此之外，活动调节的骨架相关蛋白、离子通道蛋白(如GluN2A/2B和GluA14)、双亮氨酸拉链激酶和神经细胞黏附分子等神经相关蛋白^[3]，均是由棕榈酰化作用调控。这种棕榈酰化的神经蛋白经常在特殊的膜区富集，包括突触前活跃区和突触后致密斑，从而参与组织的突触形成和精确调节突触传递。

最近10年来，有关蛋白质棕榈酰修饰位点和修饰酶在神经科学领域分子调控机制的研究才被关注并成为热点。在AD方面，研究结果证实AD典型病理特征老年斑Aβ生成的关键酶β淀粉样前体蛋白裂解酶1上有棕榈酰化位点，通过对缺乏该裂解酶棕榈酰化修饰的AD转基因小鼠模型的研究，发现了该小鼠扣带回和海马的Aβ沉积减少、脑内突触形态和功能有所改善以及学习记忆的提升^[14]。

三、PSD-95的棕榈酰化修饰及其调节作用

Fukata等^[15]通过受激发射显微技术发现了由棕榈酰化的PSD-95组成的突触后超微功能区。棕榈酰化的PSD-95聚集在突触后的超微功能区，而去棕榈酰化的PSD-95则分布到相应的细胞质中，并通过棕榈酰基转移酶(PAT)家族中的DHHC2介导的局部再棕榈酰化反应迅速地回到超微功能区。这样一种快速的树突棘内棕榈酸循环可以防止与膜结合的PSD-95向其他区域横向扩散，这反过来又确保了超微功能区结构的封闭性。此外，棕榈酸循环的速率可以通过细胞外信号改变，即神经元的突触活动增强，从而引起PSD-95的快速去棕榈酰化作用^[16]。因此，这些突触后超微功能区可能为PSD提供内在特性，以快速重组其结构和分子构成，以应对突触活动的变化。总之，有关PSD-95研究方面，突触活动调节的棕榈酸循环可以通过改变PSD-95的超微功能区来重新塑造突触后致密斑。

使用超分辨率光学显微镜的研究结果显示，在突触后致密蛋白中，AMPAR和棕榈酰化的PSD-95都集中在突触后膜超微功能区^[17]。Chen等^[18]通过电子显微镜层析成像技术发现，当PSD-95被严重破坏时，突触后膜AMPAR的超微功能区就消失了，而NMDAR的超微功能区则在PSDs中相对保留。PSD-95的棕榈酰化反应改变了其构象，当其发生棕榈酰化修饰时处于延伸状态，而在去棕榈酰化时处于聚合的紧凑状态^[19]。当PSD-95与AMPAR相关时，PSD-95的棕榈酰化更为动态，当与NMDAR相关时PSD-95棕榈酰化更加稳定。在AMPAR超微功能区中，棕榈酰化后处于延伸状态的PSD-95通过与AMPAR-TARP-PDZ结构域结合从而与AMPAR相互作用，其化学计量数为1∶1，该化学计量数可能更有助于AMPAR超微功能区中的AMPAR脚手架的活跃状态；而在NMDAR超微功能区中，棕榈酰化后延伸的PSD-95通过与GluN2B亚基PDZ结构域结合而与NMDAR相互作用，其化学计量数为2∶1，更高的化学计量数允许PSD-95与突触相关蛋白97的相互作用使二聚体的突触相关蛋白97与NMDAR结合，从而使NMDAR更加稳定^[17,19]。

此外，一些研究结果证实PSD-95的突触后定位可通过其棕榈酰化和各种下游途径、分子和酶来调节。已经证实Ca^2＋/钙调蛋白能够结合在PSD-95的N端，以阻止其棕榈酰化，从而促进Ca^2＋诱导的PSD-95从突触后膜解离^[20]。

四、与PSD-95棕榈酰化修饰相关的酶

蛋白质的棕榈酰化由PAT家族催化，该家族含有保守的Asp-His-His-Cys(DHHC)序列，目前已经报道的DHHC有23种，即DHHC1-DHHC9和DHH11-DHHC24。在HEK293T细胞中，对所有哺乳动物DHHC蛋白质的细胞内定位进行比较分析表明，这些蛋白质的大部分都被定位到内质网和高尔基体中^[21]。相反的，去棕榈酰化修饰过程则由酰基蛋白硫酯酶(APT)和棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT)修饰，其中APT1和APT2位于胞质中^[22]，PPT1和PPT2则位于溶酶体中^[23]。棕榈酰化和去棕榈酰化的动态平衡对AMPAR的稳态具有双向调节作用。

1．PSD-95棕榈酰化修饰的酶：

Fukata等^[24]证实了PSD-95的棕榈酰化由DHHC蛋白家族的DHHC2、3、7和15修饰，并且通过调节PSD-95的棕榈酰化来调节AMPAR的突触功能。其中DHHC3和DHHC2亚家族分别位于高尔基复合体和树突棘循环内体中。尽管DHHC3和DHHC2都是PSD-95在突触后位点积累所需要的，但是只有DHHC2是由减少的突触活性诱导的PSD-95动态棕榈酰化所需的。PSD-95到达其目的位置后，DHHC2维持树枝状轴突中棕榈酰化的PSD-95和胞质中非棕榈酰化的PSD-95间的平衡^[25]。此外，由DHHC2介导的棕榈酰化的PSD-95被分配到亚突触超微功能区中，该功能区对突触后致密斑中PSD-95的维持至关重要的^[26]。

2．PSD-95去棕榈酰化修饰的酶：

Yokoi等^[26]的研究确定了膜固定的含有α/β-水解酶结构域(ABHD)的丝氨酸水解酶ABHD17的3个亚型ABHD17A，17B和17C，是生理的PSD-95去棕榈酰化修饰酶，它们可以调节神经元PSD-95的棕榈酰化循环。ABHD17在神经元中的表达能够选择性地减少PSD-95的棕榈酰化和PSD-95及AMPAR的突触聚集。同时，ABHD17的过度表达也降低了HEK293T细胞中小GTP酶NRas和HRas以及PSD-95的棕榈酰化水平。

但目前调控ABHD17活性的机制仍不清楚。ABHD17B的酶活性和突触后靶向需要其N-末端棕榈酰化，这提示DHHC-PAT和ABHD17间可能存在相互依赖性调节。由此推断，通过DHHC-PAT增加ABHD17的棕榈酰化可以将ABHD17定位在突触后膜并增强去棕榈酰化活性。反过来，膜锚定的ABHD17的去棕榈酰化活性的增强可以减少DHHC家族蛋白质的自动酰化。突触的棕榈酰化和去棕榈酰化酶间的这种负反馈循环可将棕榈酰化水平保持在一定范围内，促成突触棕榈酰代谢的动态平衡^[20]。

五、PSD-95的棕榈酰化与神经精神疾病

AD主要影响认知功能，严重影响老年人的日常生活，对老年住院患者的调查结果显示，认知功能障碍者是认知功能正常者的9.94倍^[27]。AD患者脑的病理改变可见Aβ淀粉样蛋白的沉积，而Aβ能够发生棕榈酰化修饰。事实上，一些研究结果已证实其与PSD-95的联合免疫反应，Pham等^[28]通过对20例人体尸检脑标本和16例早老衰转基因小鼠脑标本的研究，证实了在人脑和小鼠模型脑中Aβ与PSD-95在兴奋性突触发生共定位。

物质成瘾是慢性并且反复性脑病，与之密切相关的是中脑边缘多巴胺系统，即大脑奖赏环路。张晓洁等^[29]通过对吗啡成瘾大鼠模型进行吗啡暴露和条件位置性偏爱训练，发现海马和伏隔核区的PSD-95蛋白的棕榈酰化程度略有升高，而撤药后，海马区PSD-95的棕榈酰化大幅度降低，而伏隔核区的则显著升高。而之后长期戒断期两脑区则恢复并维持其自然水平，这表明棕榈酰化的动态变化可能是PSD-95蛋白参与慢性吗啡暴露大鼠成瘾模型形成、戒断及复吸过程的重要机制之一。

亨廷顿病是由亨廷顿蛋白的结构改变引起的疾病，已证实与DHHC17(又称亨廷顿相互作用蛋白14，HIP14)直接相关，因为DHHC17/HIP14能通过其棕榈酰化调节亨廷顿蛋白的转运和功能，进而影响包涵体的形成和神经毒性，而亨廷顿蛋白和18谷氨酰胺重复序列可使PSD-95发生棕榈酰化并参与其突触传递^[30]。

六、棕榈酰化蛋白的研究方法

1．放射性荧光标记法：

放射性棕榈酸标记是研究蛋白质棕榈酰化最早的方法^[31]。³H-棕榈酸酯是放射性标记的棕榈酸酯最广泛使用的形式，即将标记的棕榈酸酯添加到培养基中，使其被细胞摄取并代谢地并入蛋白质棕榈酰化位点。其能通过脉冲追踪分析来确定棕榈酰化的比率，但只能在活细胞中进行，不能提供酰化程度的定量信息。

2．通过点击化学法进行生物正交标记：

生物正交标记法是一种非放射性的代谢标记，是用来识别和描述蛋白质棕榈酰化的方法。它主要依赖于高效率的铜-镍环加成反应，该反应发生在炔烃末端和叠氮化物功能，被称为"点击反应"。该法是对放射性标记法的改进，可以检测和观察活细胞中棕榈酰化的蛋白质^[32]。

3．酰基-生物素置换法：

Drisdel等^[33]提出了ABE法，ABE的机制来源于棕榈酸酯与修饰的半胱氨酸残基之间的硫酯键的不稳定性。首先须用N-乙基顺丁烯二酰亚胺完全封闭蛋白质半胱氨酸残基上所有自由巯基，然后在中性条件下用羟胺打开半胱氨酸残基上与棕榈酸结合的巯酯键，使其产生新的自由巯基，再与特异性的生物素结合，再利用链霉亲和素琼脂糖进行纯化。该方法使用过程中应注意的是确保所有的自由巯基均被封闭且羟胺完全打开棕榈酸与半胱氨酸的连接。

4．酰基-聚乙二醇置换法：

酰基交换移位分析是对ABE方法的改进。在硫代酯键裂解后，暴露的半胱氨酸残基与马来酰亚胺基化聚乙二醇试剂反应，然后与ABE方法相似的是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳以检测未被修饰的和S-棕榈酰化修饰的蛋白^[34]。由于连接了各种不同质量的聚乙二醇，该方法能够使S-棕榈酰化的蛋白的发生迁移率的改变。相对于ABE方法，其优点是对S-棕榈酰化的内源性水平和化学计量学的定量测量。

5．酰基树脂辅助捕获：

同样的，酰基树脂辅助捕获也是ABE的衍生技术，它以与ABE类似的方式起作用，但是通过直接使用硫反应性琼脂糖凝胶提取羟胺处理的蛋白质来缩短方案^[35]。这具有减少步骤和反应的优点，可以使棕榈酰基蛋白被更有效地纯化，并因此提高了对ABE的敏感性。

七、小结

综上所述，神经系统蛋白质的棕榈酰化修饰在蛋白与蛋白间相互作用、自身作用的表达、调控神经元的生长发育及可塑性变化、细胞内信号的转导及突触前膜神经递质的释放中发挥着关键作用。PSD-95的棕榈酰化与多种神经退行性疾病有重要联系，虽然目前对PSD-95棕榈酰化的研究已经较为深入，但是仍有部分机制未阐明，此外疾病的复杂性与棕榈酰化修饰的变化多样也要求我们更进一步探索。