Sulfomycins是一类富含硫原子，结构中含有一个吡啶，五个唑以及若干脱氢氨基酸的35元大环RiPPs类化合物。本文发现了sulfomycins 中五个唑的两阶段合成途径，第一阶段是双结构域环脱水酶将L-Cys2 和 L-Thr9杂环化形成唑啉，然后异三聚体脱氢酶复合物将唑啉转化为唑；第二阶段是非典型的四组分唑合酶复合物，依次将残基L-Cys7, L-Thr5, 和 L-Ser12 转化为唑。在两个阶段中， E1-样伴侣蛋白介导了活性脱氢酶异三聚体和唑合酶异四聚体的形成。本文的发现加深了对不同含唑RiPPs生物合成的认知，并且为应用基因挖掘和合成生物学方法发现，工程改造和创造新硫肽奠定了基础。
起初认为YcaO是一个未知功能的结构域，得益于RiPPs生物合成和生化研究，其功能谜团逐渐被解开，它可以催化残基L-Cys, L-Ser 或 L-Thr的亲核侧链进攻羰基形成5-元杂环，随后与ATP一起磷酸化异丙酰胺中间体消除水，由此产生的唑啉单元可被黄素单核苷酸（FMN）依赖的脱氢酶氧化，产生更稳定的，抗蛋白水解的含唑杂环肽基骨架（Fig.1），该骨架在linear azole-containing peptides (LAPs)，cyanobactins以及thiopeptide抗生素等中普遍存在。
Figure.1 Azole formation and selected azole-containing thiopeptides
作者从克隆Streptomyces viridochromogeneATCC29776中sulfomycins的生物合成基因簇入手，发现cosmid pSL5001中的16个orfs参与sulfomycins合成。sulA编码sulfomycins合成的前体肽(54aa)，其CP序列（SC2TTT5GC7TT9SSS12SSSSS）富含L-Ser,L-Thr和L-Cys残基；sulB编码Ocin-ThiF-样伴侣蛋白（F蛋白），是E1-样腺苷化蛋白ThiF的同系物，融合了一个RiPP前体肽识别元件（RRE）的保守结构域；sulC编码双结构域蛋白（E1-YcaO），即YcaO结构域N-端融合一个不同的E1样结构域；sulD和sulE分别编码单结构域的YcaO蛋白和E1-样伴侣蛋白；sulF和sulG分别编码与典型硫肽脱氢酶N-端催化结构域和C-端黄素单核苷酸（FMN）结合结构域同源的蛋白，其中sulF编码蛋白是一个具有RRE结构域和E1样结构域特征的三结构域蛋白（Fig.2）。
Figure.2 Gene cluster and schematic models of the functional complexes
前体肽SulA中的残基L-Cys2,L-Thr5,L-Cys7,L-Thr9和L-Ser12是如何选择性形成唑？这引起了作者极大的兴趣，作者首先构建了一个产1的sulA和sulBCDEFG共表达大肠杆菌系统，在该系统中进行基因突变(如Fig.3)，HPLC-MS以及HR-MS/MS检测，得四个中间体2-5，该结果初步表明，SulC很可能首先杂环化残基L-Cys2和L-Thr9产生唑啉中间体4和5，然后SulF和SulG催化4和5产生2和3，最后SulD杂环化剩余的残基L-Thr5,L-Cys7和L-Ser12。
基于上述大肠杆菌系统中基因突变的结果，作者体外表达相关酶并进行酶催化反应，结果表明（Fig.4)：SulB和SulC通过形成典型的硫肽环脱氢酶异二聚体，首先以L-Cys2作为第一个靶向残基，形成4，接着以L-Thr9为第二个靶向残基形成5；然后SulEFG异三聚体复合物与FMN以非共价键方式结合，将5转化为3，同时也可将4转化为2。
Figure.4 Processing of the residues L-Cys2 and L-Thr9 in the CP sequence of the precursor peptide SulA.
L-Cys2和L-Thr9的顺序确定后，那么残基L-Thr5,L-Cys7和L-Ser12的杂环化过程是怎样的呢？作者将SulB或SulE与SulD共孵育，发现催化3，但将SulEFG复合物与SulD共孵育，形成四组分唑合成酶复合物，却催化3转化为penta-azole1以及三唑中间体6和四唑中间体7（Fig.5）。结合产1大肠杆菌异源系统中将SulD的C-端L-Pro-富含区（该区域保守且不同的YcaO共享该区）截短实验，证明唑的形成是通过依次转化L-Cys7,L-Thr5和L-Ser12。在该过程的体内外实验中，都没有唑啉产生，说明SulEFG的脱氢活性紧随SulD的杂环化活性，功能上相互协作，这一点也从恒温滴定量热法分析实验得到证实。
Figure.5 Processing of the residues L-Thr5, L-Cys7 and L-Ser12 in the CP sequence of the precursor peptide SulA.
在L-Thr5,L-Cys7和L-Ser12转化过程中，SulE可能作为独特的伴侣蛋白发挥双重功能：SulE与SulF中心的E1-样结构域通过特殊相互作用与SulFG形成活性异三聚体脱氢酶复合酶，通过这种相互作用，它进一步介导SulD的环脱水酶活性，靶向加工肽底物以进行杂环化，这种活性得益于SulF的N-端RRE结构域（Fig.6）。
Figure 6. Paradigm for installing the five azole heterocycles in the biosynthesis of sulfomycins.
总结，文中作者揭示sulfomycins中的唑杂环通过两阶段模式合成，在第一阶段，双组分环脱水酶复合物SulBC对两个远端残基L-Cys2和L-Thr9杂环化启动前体肽的PTMs，在该过程中，SulBC环脱水酶复合物似乎独立于SulEFG脱氢酶复合物而发挥作用。在第二阶段，SulD 与SulEFG 相互作用形成一个罕见的异源四聚体，依次催化残基L-Cys7,L-Thr5和L-Ser12转化为唑。在这两个阶段，SulE在介导各种特殊蛋白蛋白相互作用中扮演着非常重要的角色和功能，这个E1样伴侣蛋白在第一阶段是SulEFG异源三聚体的必要组分，形成脱氢酶复合物，然后在第二阶段中通过形成四组分，唑合成酶复合物参与SulD的杂环化酶活性。本文的研究结果促进了对各种含唑RiPPs生物合成的理解，并将有助于利用合成生物学策略设计和开发目标肽产物。
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