四环素类抗生素是应用最为广泛的广谱抗生素之一，它们在临床上的使用已超过60年。它们的结构多种多样，但其D环中的α,β-不饱和酮结构是较为保守的。除了光神霉素类化合物，它们是由四环素中间体经过氧化开环得到的，四环素D环的α,β-不饱和酮结构是较少被修饰的。上海有机化学研究所唐功利课题组在2019年发现了一系列非典型的四环素类化合物（4-11）（详见往期推荐1），它们的D-环被不同程度的还原。近期，该课题组成功解析了高度还原D环的生物合成途径，并且通过同位素标记实验对酶催化机制进行了一定的阐释。
首先，作者发现TjhO5可以成功将底物15转化为两个新的产物，这两个化合物虽然质谱数据与所推测的产物4相同但保留时间并不相同。为了进一步探究该反应，作者通过大量酶活测试成功分离得到其中的主要产物16，并鉴定了16的化学结构。16的ABC环与15相同但其C-10的羰基被还原为CH2，而且C-7位羟基构型发生了翻转。该结果说明形成最终的产物应该需要更多的酶参与后续的还原反应。
通过生物信息学分析，作者认为还原异构酶TjhD4很可能是参与后续反应的酶。体外初步酶活测试发现TjhD4确实可以将中间体16转化为D环完全还原的产物8和17。但是8和17均为野生型菌株发酵液中的次要产物，在该酶活体系中并未检测到主要骨架4。有趣的是，作者在TjhD4和TjhO5的一锅法体外酶催化实验中成功检测到了微量的产物4，且4的产量随着TjhO5的减少大幅度提升。该结果表明，只有TjhO5和TjhD4同时存在时才可以产生4，且过量的TjhO5可能会消耗4。接下来作者将TjhO5与化合物4孵育，发现TjhO5确实可以将4进一步还原为8和17。上述实验结果表明，从15到完全还原的8和17可以经过两个不同的生物合成途径（A和B）。途径A中TjhO5可以还原16的C-10位羰基且催化C7位羟基构型反转得到中间体16，16可以被TjhD4进一步还原异构为8和17。途径B中TjhO5和TjhD4共同还原15可得到4，4再经过TjhO5的还原得到最终的化合物。
为了进一步探究酶催化的机制，作者用不同的葡萄糖脱氢酶的循环体系确定了TjhO5和TjhD4分别作用于C-10位和C-8位。接下来，在H218O和D2O实验中，作者发现A和B途径的酶催化机制并不相同，而且TjhO5还原羰基过程中存在一种特殊的脱氧机制，其C-10位脱氧可能是通过氧转移来实现的。
作者在体外成功解析了四环素类化合物D环的还原性修饰。该多步还原过程需要TjhO5和TjhD4两个酶的共同参与。TjhO5首先还原15的羰基形成18，当TjhD4不存在时，TjhO5再次还原18形成16；16可被TjhD4转化为最终的化合物8和17。在这一过程中，TjhO5可以单独实现羰基的还原，羟基的脱除以及异构三个步骤。而TjhD4与TjhO5同时存在时，18则会立刻被TjhD4转化为4，4再最终被TjhO5还原为最终化合物。该工作可能对未来的生物催化，还原酶的功能预测，基因组挖掘等有一定的启示性。本文通讯作者为中国科学院上海有机化学研究所唐功利研究员，第一作者为上海有机化学研究所助理研究员聂秋玥。该工作得到国家自然科学基金委和科学院先导B等项目的支持。
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