手性β-硝基醇是最为重要的硝基化合物之一，是多种医药中间体、生物活性物质和精细化学品合成的关键手性砌块。手性β-硝基醇的合成长期依赖于动力学拆分、不对称还原和不对称Henry反应三条技术路线，均需采用硝基官能化底物，原料价格昂贵，合成工艺复杂，已不能满足绿色化学的发展需求。开发一种以廉价亚硝酸盐原料出发直接硝化制备手性β-硝基醇的新合成策略具有重要研究意义。

卤醇脱卤酶可以催化邻卤醇脱卤形成环氧化物，也可以催化亲核阴离子（如N₃^-、CN^-和OCN^-等）介导的环氧开环反应，生成对应的β^-取代醇。D. B. Janssen课题组早期研究发现亚硝酸根离子（NO₂^-）可参与卤醇脱卤酶催化的环氧开环反应（Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 1685-1692），但该反应过程复杂，存在不同反应路径（图一所示）。亲核试剂NO₂^-可以通过O原子或者N原子进攻环氧化物的Cα或者Cβ。其中，以O原子进攻开环可形成亚硝酸酯区域异构体，其可进一步水解得到邻二醇，类似一种水解反应；而以N原子进攻开环可生产β-硝基醇，是一种硝化反应。目前已有的卤醇脱卤酶主要以O原子亲核进攻环氧化物底物，以邻二醇作为主产物。N-亲核进攻选择性卤醇脱卤酶未见报道，卤醇脱卤酶介导的生物硝化过程的区域与立体选择性原理也未得到完整揭示。因此，对该反应的化学选择性、区域选择性和立体选择性进行三重调控，进而精准合成手性β-硝基醇化合物，是一项非常具有挑战性的研究工作。

近日，浙江工业大学郑裕国院士团队柳志强教授联合遵义医科大学陈永正教授、万南微教授团队通过基因挖掘策略获得一种特殊的卤醇脱卤酶HHDHamb，可在酸性和低温反应条件下对环氧化物进行高化学、区域和立体选择性硝化，成功建立了一种手性β-硝基醇的生物硝化合成新策略，实现了手性β-硝基醇的高化学、区域和立体选择性高效制备。

课题组首先以环氧苯乙烷为模板底物，对实验室保藏和新挖掘的共36种卤醇脱卤酶进行筛选，获得来源于Acidimicrobiia bacterium的卤醇脱卤酶HHDHamb，具有良好的N-进攻开环化学选择性和α-区域选择性，以β-硝基醇（2-硝基-2-苯基-1-醇）为主产物，但其光学纯度较低（44% e.e.）。对反应过程进行构建与调控，构建了pH 5.2 和0.5 ℃的极端生物不对称硝化反应体系，有效抑制了手性β-硝基醇的消旋化，获得β-硝基醇的分析产率和光学纯度分别达到43.5%和96% e.e. (R)。

在此基础上，对反应条件进行了系列优化，以E. coli (HHDHamb)静息细胞作为生物催化剂，考察了生物硝化反应的底物普适性，获得了一系列含手性硝基基团的β-硝基醇化合物，分离收率和光学纯度分别高达41%和>99% e.e.（图二a所示）。与此同时，该生物硝化反应可以在100 mM底物浓度下快速反应（图二b所示），实现手性β-硝基醇的克级合成（38%分离收率，97% e.e.）。

最后探讨了卤醇脱卤酶催化生物硝化反应的选择性调控原理。通过解析HHDHamb的晶体结构（PDB ID: 7WKQ），并与卤醇脱卤酶HheC（低N^-进攻开环化学选择性）和HheG（中等N^-进攻开环化学选择性）进行结构比较分析，结合分子对接发现，卤醇脱卤酶的卤离子结合区域（同时也是亲核离子结合区域）的静电势影响了NO₂^-的结合构象，导致NO₂^-的N原子和O原子与底物环氧环的距离存在差异，从而影响了亲核进攻环氧化物底物的化学选择性（图三所示）。

综上，该研究创制了多重选择性选择性卤醇脱卤酶催化剂，提出了酶分子活性中心卤素结合域静电势调控底物构象理论，以廉价的亚硝酸作为硝化试剂，成功建立了手性β-硝基醇的生物硝化合成新策略，丰富了酶催化手性C-N键构筑方法。为手性β-硝基醇类化合物的绿色生物制造技术展示了良好的研发与应用前景。