分享一篇发表在Angew上的文章，题目为“Core-Shell Reactor Partitioning Enzyme and Prodrug by ZIF-8for NADPH-Sensitive In Situ Prodrug Activation”。 文章的通讯作者是来自中国药科大学药品质量控制与药物警戒教育部重点实验室的丁娅教授，其主要方向：细胞膜工程化用于肿瘤治疗、金属有机骨架用于核酸标志物检测和肿瘤治疗、mRNA疫苗的跨膜递送。

  细胞色素P450 (CYP450)是肝微粒体系统的主要组成部分，也是大多数前药的特异性代谢酶，由于CYP450在肝脏中高表达，所以通常在肝脏前药转化，形成的活性药物通过体循环到达症状部位。这一过程导致严重的肝毒性和潜在的全身毒性，此外，CYP450易受外源性药物或环境因素的影响，表现出个体异质性。因此，实现酶和前药的时空调控，维持甚至提高靶位点酶的活性是具有挑战性的，但也具有重要意义。

  由有机配体和金属节点(离子或纳米团簇)组装而成的金属有机骨架(MOF)是具有超大比表面积的多孔网状材料，它们不仅可以保护酶的结构和活性，而且在酶在特定位点的传递中作为载体发挥重要作用。为了实现酶和前药在肿瘤中的共定位，将酶和前药分别包封在ZIF-8和PCN-333(AL)中。然而，MOF基材料的载药量(DLC)通常小于15%，由于固定化酶的持续催化能力，使前药在原位耗竭会限制酶活化效率。最近，作者提出使用前药作为有机配体直接构建MOF，称为PROMFS。该方法通过与金属节点的相互作用提高了药物稳定性，而且将DLC显著提高到66.4%。然而，由于大多数前药的结构对称性较低，因此所得的PRO - MOF具有许多结构缺陷。有报道称，具有结构缺陷的MOF可能更有利于提高酶的催化效率，但这些MOF容易导致酶的漏失和催化反应的提前发生。因此，在保持酶活性的同时增加系统中前药的比例是MOF固定化酶-前药治疗的关键问题。

  为了解决(1)酶和前药的时空控制，(2)维持甚至提高酶的活性，(3)前药在靶位点的原位耗用等问题，作者提出了一种新型的核-壳反应器，通过沸石咪唑酸框架(ZIF-8)分配酶和前药。首先将CYP450固定在ZIF-8中，然后抗恶性黑色素瘤前药达卡巴嗪(DTIC)沉积在ZIF-8外层，DTIC作为表面配体可增加DLC。这种独特的核壳结构将酶及其前药底物整合和分割在一个颗粒中，且该堆壳反应器在生理环境中具有较高的稳定性。反应器被肿瘤细胞吸收后，在溶酶体酸性条件下降解后释放带正电荷的2-甲基咪唑(2-MIM)和DTIC，通过质子海绵效应帮助溶酶体逃逸CYP450。有趣的是，CYP450在反应器中的催化活性只能在肿瘤细胞细胞质中存在高浓度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)时发挥作用，将DTIC转化为甲基阳离子(方案1B和1c)这些甲基阳离子诱导DNA甲基化和随后的肿瘤细胞凋亡(方案1B)利用透明质酸的肿瘤靶向能力，核壳酶反应器在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中显示出较高的肿瘤抑制率。

方案1

ZIF-8@DTIC (ZD)的制备与表征

  为了制备核壳酶反应器，首先将Zn2+与2-MIM配位制备ZIF-8，并使用了四种含五元氮杂环基团的药物，作为前药在ZIF-8上构建外壳，包括DTIC(方案1C)、替莫唑胺、来曲唑和6-硫鸟嘌呤(图1A)参与随后的配位过程。在这些药物中，只有DTIC能够协同作用于ZIF-8的外层。

  加入DTIC配位后，ZIF-8的流体动力直径从110.4 ~ 3.7 nm到176.4 ~ 1.6 nm(图1B)，但zeta电位几乎没有变化(图1C)。TEM和 SEM图像显示，ZIF-8形貌由十二面体变为球形。 EDX成像表明表面Zn和N元素的均匀分布高度相关(图1F)，表明Zn2+均匀分布在整个颗粒中。而羰基DTIC中O元素主要分布在粒子的外层，表现出含的ZD壳层分布。且ZD的壳结构不受Zn2+浓度的影响，即使没有额外的锌离子加入也会形成壳，作者推测壳的形成涉及Zn2+和DTIC之间的配位作用。

  为了阐明核壳反应器的形成机理和外层结构，测定了甲醇浸泡前后ZD的 XRD谱图。作者发现ZD不仅保持了ZIF-8的晶体结构，而且出现了新的衍射峰，这一发现表明，在ZD的骨架结构中掺杂了少量的DTIC晶体。相比之下，用甲醇浸泡和洗涤的ZD样品只显示出与ZIF-8相似的XRD模式，尽管大部分DTIC仍保持在MOF结构中(蓝色虚线，图1G)。这些结果表明，该反应器是由ZIF-8核和由Zn-DTIC配位化合物组成的杂化壳组成的核壳结构。然而，ZD的壳层不是均匀的MOF结构，而是由配位DTIC和沉积DTIC组成，HPLC分析显示，它们的比例分别为71.6%和28.4%。因此，这种独特的结构赋予了ZD极高的DLC，这可以归因于Zn2+与DTIC.的配位作用，FITC表明DTIC中咪唑环、羰基和酰胺基参与了与Zn2+的配位作用。

图1

CYP450负载ZIF-8@DTIC (CZD)的制备、表征及体外特性

  为了实现原位药前激活，作者采用一锅法将CYP450包封在ZIF-8中(记为CZ)。增加进料液中CYP450的浓度会导致CZ的水动力直径增加。然而，CZ的zeta电位几乎没有变化，这表明CYP450被包裹在ZIF-8中而不是在其表面。SDS-PAGE分析显示，在ZIF-8的框架中，CYP450的完整结构被保留。当投CYP450为100 μg/mL时，CZ上清中未检测到游离蛋白，蛋白负载效率(PLE)几乎为100%。通过BCA分析确定CZ的蛋白质负载能力(PLC)为1.1 ~ 0.1%(图2C-2E)。随后，2-MIM被解离，DTIC与CZ的壳结合得到CZD。与ZD的制备类似，CZ保留了ZIF-8的十二面体形态(图2A)，但加入DTIC后CZD的形状变为球形(图2B)。采用 (BET)测量法估算CZ和CZD的表面积。CZD对N2气体具有明显的I型吸附， DTIC配位在CZD外层产生了一些孔洞和微孔，这可能是导致CZD比表面积和孔体积增大的原因BCA法测定CZD的PLC为0.85±0.02%(图2C-2E)，HPLC法测定其DLC为40.9±4.9%。对CZD的上清进行BCA测定，结果表明在成壳过程中没有蛋白渗漏。

  通过监测流体动力直径的变化，评估了CZD在不同介质中的稳定性(图2G)。作者发现CZD在PBS (0.03 M和0.2 M, pH 7.4)和细胞培养基中表现出良好的尺寸稳定性 (图2F和2G)。在pH 7.4的0.03 M PBS中浸泡48 h后，CZD保持完整的晶体结构，形貌略有变化， Zn-DTIC外壳的稳定性维持了CZD的形态，避免了pH 7.4下PBS中药物和酶的泄漏(图2H和2I)。然而，当颗粒浸泡在pH为5.5的0.03 M PBS中时，由于颗粒分解和残余结构聚集(图2G)，悬浮液很快变得清晰(图2F)。为了研究CZD中DTIC和CYP450的释放情况，将样品浸泡在pH 7.4和5.5的PBS中48小时(图2H和2I)。DTIC和CYP450在pH 7.4时释放缓慢，而在pH 5.5时释放迅速，表明MOF结构在生理环境中具有较高的稳定性，但在肿瘤或溶酶体酸性环境中会发生结构解离。还发现DTIC的释放速度比CYP450快。在pH 5.5条件下24小时内，分布在壳内的DTIC有87%被释放(图2H)，而在pH 5.5条件下孵育36小时后，包封在核心内的CYP450只有80%被释放(图2I)。

图2

肿瘤细胞中NADPH敏感的前药激活

  为了原位验证CZD在肿瘤细胞中持续的药物生产能力，在孵育24小时后检测了CZD对多种细胞的细胞毒性， CZD对所有肿瘤细胞（B16-F10；HepG2；MDA-MB-231）都表现出明显的细胞毒性，其中B16-F10细胞比其他细胞更敏感(图4A)。为了揭示CZD对B16-F10细胞的选择性，作者测定了NADPH/NADP+比值，并与正常人肝细胞(L02)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行了比较。作者发现B16-F10细胞的NADPH/NADP+比值比L02细胞和HUVECs高1.5倍以上，这可能导致了不同的前药激活作用(图4B)。与DTIC、CZ和ZD相比，只有CZD对B16-F10细胞表现出剂量依赖性的细胞毒性(IC50为26.3 ~ 2.6 μg/mL)，而对L02和HUVECs的影响较小(图4C)。同样，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察到的细胞活/死染色也证实了DTIC的激活导致细胞死亡(图4D)。

  为了揭示酶反应器的细胞摄取机制和细胞内催化过程，作者将FITC加载到ZD中，取代CYP450，得到FITC负载的ZD (FZD)。首先用氯丙嗪、染料木素和wortmannin等各种抑制剂对B16-F10细胞进行预处理和不预处理，并通过流式细胞术分析测量FZD的细胞摄取(图4F)。染料木素和wortmannin对FZD的细胞摄取没有明显的影响，而氯丙嗪对FZD摄取的抑制作用超过50%(图4G)，表明了网格蛋白介导的内吞机制根据DTIC的药理机制，通过CYP450代谢为CH3 +并使细胞核中的DNA甲基化。为了在细胞中证实这一过程，FZD被用来跟踪酶反应器的细胞分布。CLSM观察(图4H)：在B16-F10细胞中，培养4 h后FITC的绿色荧光与LysoTracker的红色荧光有很好的重叠，这与作者前面论证的网格蛋白介导的内吞机制一致。在新鲜培养基中再孵育8 h后，绿色荧光扩散到细胞质中，溶酶体难以染色(图4H为12 h)。这一发现表明溶酶体的逃逸和破裂是由于含有咪唑基团的DTIC和2-MIM的质子海绵效应。

图3

体内肿瘤靶向性、治疗有效性及安全性

  为了研究核壳酶反应器的抗肿瘤作用，作者采用C57BL/6 J小鼠原位植入建立B16-F10黑色素瘤小鼠模型。每2天静脉注射生理盐水、游离DTIC、ZDH、CZD和CZDH (图5A)。与游离DTIC相比，ZDH对肿瘤的抑制作用最低，仅次于生理盐水(图5B和5c)。这表明大多数药物可以通过HA靶向肿瘤组织。值得注意的是，与其他制剂相比，用CZDH治疗组的相对肿瘤体积(RTV)明显受到抑制(图5B和5c)，第14天，CZDH组的肿瘤重量也是其他组中最低的(图5D)。值得注意的是，在治疗的第6天，该组有3个肿瘤消失，这说明了CZDH反应器的良好治疗效果。同时，CZDH组的毒性也最低。CZDH组小鼠体重的轻微变化(图5E)和最高的存活率(100%，图5F)表明其具有优越的安全性

  这种提高的抗肿瘤疗效和生物安全性可能是由于精确的肿瘤位置的反应器。因此，通过HPLC和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法，在静脉注射后不同时间检测反应器的体内生物分布，如DTIC和Zn2+在正常器官和肿瘤中的含量。在被动靶向CZD的基础上，肿瘤中的DTIC水平(8 h时为1.36 ~ 0.72 μg/g)高于其他器官。这种精确的CZDH蓄积使药物在肝脏中的分布最小化，同时增加了肿瘤蓄积，这证实了体内生物催化更有效、选择性和安全性。肿瘤组织进行组织学分析，H&E和TUNEL染色均显示，czd处理组肿瘤组织出现肿瘤坏死和凋亡，但坏死和凋亡细胞密度明显低于CZDH处理组(图5G)。

图4

  总之，作者提出了一种新的核壳CYP450反应器。该结构由一个ZIF-8核心和一个Zn-DTIC框架外壳组成。CYP450反应器在黑色素瘤治疗的有效性、选择性和生物安全性方面具有若干优势。该反应器允许在肿瘤细胞内同步递送CYP450及其底物DTIC。CYP450在核壳结构的保护下能够维持其催化活性。CYP450反应器被肿瘤细胞内化后，它们通过含咪唑环配体介导的质子海绵效应从溶酶体中逃逸。肿瘤细胞中NADPH/NADP+比值较高，这可能是反应器选择性激活抑制细胞增殖的原因。此外，CYP450反应器的高载药能力可以保证前药在肿瘤细胞中的持续活化。最后，CYP450反应器在B16-F10荷瘤小鼠模型中显示出良好的抑制生长和增殖的能力，副作用可以忽略不计。因此，这种核壳反应器为处理作者在酶前药物治疗领域遇到的几乎所有问题和丰富基于ZIF-8的生物学应用提供了一种新颖而直接的策略此外，这种纳米反应器也提供了前景，在治疗癌症或其他需要酶代谢药物的疾病方面具有很大的潜力。 

本文作者：WQY

责任编辑：LRC

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37881154/

DOI：10.1002/anie.202314025