背景：基于肽激素的靶向肿瘤治疗是一种选择性阻断肿瘤生长和扩散的批准策略。在不同肿瘤（例如，黑素瘤）上过表达的促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）可以通过应用GnRH类似物作为载体用于药物靶向，以将共价连接的化学治疗药物直接递送至肿瘤细胞。在本研究中，我们的目标是（i）分析GnRH-药物偶联物对黑素瘤细胞增殖，粘附和迁移的影响，（ii）研究肿瘤细胞反应的机制，以及（iii）比较缀合物的活性。免费的药物。
结果：在测试的结合物中，柔红霉素（Dau）与8 Lys的GnRH-III（GnRH-III（Dau = Aoa））偶联，或其衍生物用4 Lys用短链脂肪酸（乙酰基在[ 4]中酰化。赖氨酸（AC）] -在[促性腺激素释放激素III（DAU = AOA）和丁酰基4点的Lys（BU）] -的GnRH-III（DAU = AOA））。A2058黑色素瘤模型细胞对结合物的摄取被证明是时间依赖性的。使用xCELLigence SP系统进行基于阻抗的增殖测量显示，所有缀合物均引发通过磷酸肌醇3-激酶依赖性信号传导介导的不可逆的肿瘤生长抑制作用。GnRH-III（Dau = Aoa）和[ 4 Lys（Ac）] - GnRH-III（Dau = Aoa）显示为G2 / M期细胞周期的阻滞剂，而[4 Lys（Bu）] - GnRH-III（Dau = Aoa）诱导细胞凋亡。在短期内，所有测试的缀合物显着增加黑素瘤细胞粘附。位置4中GnRH-III的修饰伴随着细胞摄取增加，细胞毒性和细胞粘附诱导剂活性增加。通过全息显微镜研究A2058细胞的细胞运动，发现黑素瘤细胞的迁移行为增加[ 4Lys（Ac）] - GnRH-III（Dau = Aoa），而GnRH-III（Dau） = Aoa）和[ 4 Lys（Bu）] - GnRH-III（Dau = Aoa）降低了这种活性。
结论：结合物的内化和细胞毒性表明，GnRH-III肽可以保护Dau至黑素瘤细胞并促进抗肿瘤活性。[ 4Lys（Bu）] - 具有丁酰侧链作为“第二种药物”的GnRH-III（Dau = Aoa）由于其细胞毒性和对肿瘤细胞扩散的固定作用而被证明是靶向肿瘤治疗的最佳候选者。还明确提出阻抗测定法和全息相成像用于表征癌细胞行为和具有小结构差异（例如，4 Lys中侧链长度）的靶向化学疗法的效果的适用性。
关键词： 药物靶向结合物; 促性腺激素释放激素-III; 全息显微镜; impedimetry; 短链脂肪酸
更多选择性靶向药物的应用在肿瘤治疗中变得越来越重要，其中治疗指数低的化疗药物的使用受到这些药物对正常细胞毒性的不良事件的限制[1]。减少对健康组织的这种细胞毒性作用的最有希望的方法之一是使用专门针对癌细胞的药物递送系统。化学治疗药物靶向通常基于某些肽激素的受体，所述肽激素优先由癌细胞表达。这些受体用于癌细胞靶向的使用允许最小化毒性副作用并在肿瘤部位选择性地产生高药物浓度。通常，药物递送系统由靶向部分组成，以识别肿瘤细胞上的受体和直接或通过合适的接头共价连接的细胞毒性药物[1,2]。
促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）是在多种肿瘤中过表达的受体之一，在正常外周组织中表达有限[3]。GnRH本身是一种十肽激素，它通过整合脑垂体中的神经和内分泌系统来控制性腺类固醇生成和配子发生[4]。关于靶向化学疗法，据报道，几种天然GnRH类似物（包括两种人同种型（GnRH-I和GnRH-II）及其合成衍生物）在不同类型的肿瘤中发挥抗增殖作用是非常有利的（例如， ，乳腺癌，子宫内膜癌[5]）和无关（如黑色素瘤，结肠癌[6,7]）到生殖器官。考虑到这些方面，GnRH可以作为靶向单元，目的是增加过表达GnRH-R的肿瘤细胞中附着的细胞毒性药物的浓度，并减少缺乏GnRH-R的正常细胞的不必要暴露[8]。一旦药物靶向缀合物与其肿瘤特异性受体结合，受体 - 缀合物复合物可通过受体介导的方式内化到细胞中，其中附着的药物应从缀合物中释放以发挥其抗肿瘤活性[1]。
第一批GnRH-药物杂交种是由Schally及其同事开发的[9]。他们最有效的结合物之一是zoptarelin多柔比星（以前称为AEZS-108或AN-152），其中超级激动剂[D - 6 Lys] -GnRH-I允许肿瘤靶向通过共价连接的传统化学治疗药物多柔比星酯键[3,10]。然而，在II期试验中，zoptarelin阿霉素显示出有希望的抗肿瘤活性，并且复发性子宫内膜癌的不良反应发生率较低[11]。在III期研究中，使用zoptarelin阿霉素或阿霉素治疗的患者在药物疗效和不良反应发生率（如蒽环类药物典型的心脏疾病）方面没有显着差异[12]。由于酯键的不稳定性和（ii）[D - 6 Lys] -GnRH-I诱导的内分泌副作用[8]，所以认为副作用与（i）从结合物早期释放的多柔比星有关。因此，最近的靶向化疗策略有利于缀合方法，导致缀合物在体循环中更好的稳定性以及对肿瘤的GnRH-R具有高亲和力和可忽略的内分泌活性的GnRH衍生物[13,14]。
GnRH-III（Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2）是GnRH的天然变体，可在乳腺癌，前列腺癌，结肠癌细胞系中显示出强烈的抗增殖作用。 ，而诱导LH释放比GnRH-I衍生物少500-1000倍[14]。在我们先前的研究中，Lys 8的侧链用于通过氨基氧基乙酰基（Aoa）接头通过更稳定的肟键连接柔红霉素（Dau）以形成不同的含药物缀合物[15,16]。基于酶促稳定性和不同Dau-GnRH-III缀合物提供适当的细胞内药物释放的能力[15]，肟键用于在后续研究中将Dau偶联至GnRH-III或其衍生物。
有一些因素可能从根本上限制基于GnRH-III的靶向的有效性：（i）肽部分的相对快速的蛋白水解降解[17]，（ii）癌细胞上GnRH-R的可变密度[ 18），（iii）受体 - 缀合物复合物的缓慢受体介导的内吞作用和（iv）GnRH-R的脱敏[4,18]。
的3 Trp- 4丝氨酸键是通过蛋白水解酶（例如，胰凝乳蛋白酶，血管紧张素转化酶）裂解的最敏感部位。用其N-甲基类似物（N-Me-Ser）或乙酰基-Lys（Lys（Ac））取代Ser 4可以改善缀合物的蛋白水解稳定性[17]。体外和体内测定的结果证明，在4位含有Lys（Ac）和在8位含有Dau（[ 4 Lys（Ac）] - GnRH-III（Dau = Aoa））的缀合物具有更高的肿瘤生长抑制活性。比未修饰的基于GnRH-III的（GnRH-III（Dau = Aoa））[17]。值得一提的是，该位置的游离赖氨酸也增加了缀合物的体外细胞抑制作用; 然而，它的细胞摄取和酶稳定性甚至低于母体结合物[17]。因此，它没有用于任何进一步的实验。基于这些发现，开发了下一代Dau-GnRH-III生物缀合物，其中4位的Ser被Hegedüs等人用具有2-6和13个碳原子的短链脂肪酸酰化的Lys取代。[19]。更换4被Lys丝氨酸具有2-6个碳原子的链导致增加细胞抑制效应，同时与肉豆蔻酸（13个碳原子）的共轭比的GnRH-III（DAU = AOA）具有较低的活性。在这些结合物中，[ 4Lys（Bu）] - 含有在4 Lys残基酰化的丁酸（Bu）的GnRH-III（Dau = Aoa）被证明是所有不同测定中最有效的（酶稳定性，细胞摄取和体外抗肿瘤活性）。 ）对HT-29结肠癌细胞系的影响[19]。具有短脂肪酸侧链（2-6个碳原子）的缀合物的不同疏水性可被排除，作为其不同酶稳定性和细胞摄取的解释，因为发现这些缀合物具有相似的辛醇 - 水分配指数和膜渗透性。 。然而，结合物与肉豆蔻酸的较高疏水性（较低溶解度）似乎与其增加的稳定性，细胞摄取和较弱的抗肿瘤活性相关[17,19]。。由短链脂肪酸作为“第二种药物”酰化的Dau-GnRH-III结合物的细胞抑制活性增加可能是由于已知短链脂肪酸 - 尤其是丁酸 - 在各种肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的潜力。线（如结肠[20]，乳腺癌细胞[21]）。基于前一种受体结合实验，具有Lys（Ac）或Lys（Bu）的缀合物具有更适合的受体结合结构，其在丁酰侧链的情况下更优选; 然而，与4 Lys 连接的甚至更长的侧链可能对缀合物与GnRH-R的N-末端部分的拟合产生负面影响。在这些发现的基础上[ 4选择Lys（Bu）] - GnRH-III（Dau = Aoa）用于进一步研究（例如，体内实验[22]）以评估该缀合物对靶向化学疗法的适合性。
尽管化疗和手术策略有所改善，恶性黑色素瘤仍然是导致皮肤癌死亡的主要原因。传播转移和对化疗产生耐药性的强大能力导致预后不良，尤其是晚期病例[23]。表达GnRH-R在来自原发性肿瘤或转移瘤和细胞系的非常高百分比的人黑素瘤样本中得到证实[24]。通过GnRH激动剂激活这些受体显示出显着降低黑素瘤细胞系的增殖和运动性，并且含有药物的GnRH缀合物（AN-207）的肿瘤生长抑制作用清楚地表明GnRH-R受体是合适的。用于靶向肿瘤治疗[24,26]。除了GnRH变体（例如戈舍瑞林）的良好抗肿瘤活性外，它们对肿瘤细胞迁移和侵袭的负面影响也在黑素瘤细胞系中得到证实[25,26]。
还有证据表明，包括丁酸钠和丙戊酸在内的短链脂肪酸可以抑制体外黑素瘤细胞的增殖（如A2058 [27]，B16细胞系[28]）和体内实验[ 28,29]或者可以消除抗癌药物的耐药性，因为它们与其他化疗药物共同给药[29,30]。然而，关于短链脂肪酸对黑素瘤细胞转移能力的影响存在一些争议，因为已经描述了侵入性[31]和抗侵入[29,32]活性。
综合上述发现并考虑肿瘤细胞粘附和迁移表型受损的关键作用，我们假设用含有Lys的短链脂肪酸取代的Dau-GnRH-III结合物不仅具有细胞毒活性，而且对细胞粘附和黑素瘤细胞迁移也有调节作用。在我们目前的工作中，3 Dau-GnRH-III结合物的作用 - 携带4 Lys与乙酰或丁酰侧链的那些“第二种药物”（[ 4 Lys（Ac）] - GnRH-III（Dau = Aoa），[ 4 Lys（Bu）] - GnRH-III（Dau = Aoa））和亲本结合物GnRH-III（Dau = Aoa）（图1）） - 对其细胞生物活性及其对靶向黑素瘤治疗的适用性进行了调查。通过表征细胞摄取，抗增殖/细胞毒活性，缀合物的细胞粘附和迁移调节剂作用及其诱导细胞凋亡或细胞周期停滞的能力，评估GnRH-III第4位上述修饰的重要性。 A2058黑色素瘤细胞系。