通过免疫亲和层析和尺寸排阻（SE）色谱法从昆虫细胞中纯化GAT1 / GFP融合蛋白

建立了来自Sf 9细胞的GAT1 / GFP融合蛋白的两步纯化方法。首先用mAb-GFP抗体 - 缀合的亲和层析分离在Sf9细胞中表达的GAT1 / GFP 。随后，合并含有GAT1 / GFP蛋白的洗脱级分，并用Superdex 200 TM柱进行基于SE（SE-FPLC）的快速蛋白质液相色谱，以获得纯化的同源GAT1 / GFP融合蛋白。

为了从单克隆抗GFP抗体（mAb-GFP）共轭亲和柱中分离GAT1 / GFP蛋白，测试了不同的洗脱缓冲液（具有不同的pH值和离子强度）以获得GAT1 /的有效和适当的洗脱条件。 GFP蛋白质不会不可逆地使其变性或失活。由于在纯化过程中没有简单有效的方法来控制GAT1蛋白的活性，因此选择含有4 M MgCl 2（pH 6）的近中性高盐缓冲液（图3）以避免GAT1的不可逆聚集，这可能是是由高pH值引起的。

使用SE-FPLC进行第二纯化步骤以从免疫亲和柱的洗脱液中除去洗脱的抗体和其他杂质。GAT1 / GFP蛋白的洗脱曲线显示在图4A中。与标准蛋白质（图4B）相比，出现两个主峰（1和2），分别对应于320和162kDa的M r。通过SDS-PAGE（7.5％）进一步分析SE-FPLC后8.8至11.8mL的级分（每个级分300μL），然后进行银染和Western印迹（图4C）和4D）。结果表明峰1应该对应于分子量为320kDa的四聚体GAT1 / GFP，出现在8.8-10.6mL（泳道2-8）。峰2应对应于分子量为162 kDa的二聚体形式，但尽管其具有强烈的紫外线（UV）吸收，但根据银染，蛋白质印迹和二辛可宁酸（BCA）的结果，它含有非常少的GAT1 / GFP蛋白。检测。为了防止蛋白质在纯化过程中形成低聚物，测试了不同的洗涤剂，并且发现n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM，0.05％）有效地将蛋白质保持为其单体形式（图5A）。SE-FPLC洗脱曲线如图5A所示。峰值1出现在13.5-14 mL，对应的分子量约为70 kDa，重叠峰2（14.7 mL）对应的分子量为45 kDa，这是通过与蛋白质标准品的比较确定的（图4B）。

透射电子显微镜（TEM）分析

使用低温TEM（cryo-TEM）分析来自SE-FPLC的两个峰，以避免样品干燥和染色盐的推定影响。已知通过样品硝化的冷冻固化将样品保持在缓冲环境的天然状态，并且相应地，冷冻显微镜允许直接观察处于完全水合状态的蛋白质。在BCA对照后，含有较大量蛋白质的峰2的部分通过冷冻TEM表征并且显示出非常单分散的颗粒分布（图5B），其直径在5-6nm范围内，这可能对应于蛋白质单体。峰1部分仅含有少量GAT1 / GFP蛋白，其部分以聚集形式存在（图S4，支持信息文件1）。

观察到一些具有高对比度的明显小颗粒。据报道，DDM胶束的半径约为2.6-3.5 nm [32]然而，观察到的高对比度对于洗涤剂胶束来说并不典型。由于尚不清楚颗粒是否可以简单地归因于球形胶束，因此进行了低温TEM实验。使用含有0.05％DDM的Tris缓冲盐水（TBS）溶液（远高于DDM的临界胶束浓度（CMC）：0.009％或0.18mM），未发现明显的胶束群。这些结果表明观察到的颗粒最可能对应于GAT1 / GFP的单分散制剂。一些研究已经证明GAT1在质膜中以寡聚体形式表达。GAT1二聚体表达并作为非洲爪蟾卵母细胞质膜中9nm冷冻断裂颗粒的独特群体进行检测通过冷冻断裂和电子显微镜[33]。确定GAT1蛋白单体是功能单元，因为每种单体独立地起作用[33,34]。类似的例子是细菌同系物LeuT，它也被结晶成二聚体[13]，然而，每种单体都有自己的结合口袋，表明单体是功能单元。因此，GAT1 / GFP融合蛋白单体可适用于进一步的结构分析。通过BCA测定法定量，从400-600mL感染的Sf9细胞获得该级分中约200-300μgGAT1/ GFP蛋白的产量。