Megasynthases是大型多酶蛋白，通过催化前体单元的连续缩合和修饰产生过多的重要天然化合物。在超合成酶类中，聚酮化合物合成酶（PKS）负责产生大范围的生物活性聚酮化合物（PK），其经常被用于治疗应用。在过去的25年中，人们开始采用合理的工程方法，寻求采用megasynthases的“装配线合成概念”，以提供新的生物活性化合物。在这里，我们根据新出现的megasynthases结构信息强调PKS工程策略，并认为脂肪酸合成酶（FAS）是进一步发展该领域的有价值的对象。
关键词： 脂肪酸合成酶; megasynthases; 代谢酶工程; 聚酮合酶; 蛋白质设计
Megasynthases是天然化合物合成中的蛋白质
微生物天然产物代表了药学相关化学实体的丰富来源。主要类别是聚酮化合物（PK），例如抗生素红霉素和利福霉素，抗肿瘤阿霉素和抗寄生虫阿维菌素（图1a）[1]。PK由酰基辅酶A（酰基辅酶A）单元通过聚酮化合物合成酶（PKS）催化的一系列克莱森型缩合反应组装而成（图1b）。PKS作为大型多功能酶发生，称为megasynthases，其在大多肽上具有超过一个MDa大小的催化结构域[2]。PK化合物以线性方式组装，其中多个模块连续地将前体单元缩合成最终化合物（模块化系统）[3]，或以递归方式，单个模块的催化结构域重复冷凝前体单元直至特定获得长度/尺寸（迭代系统）[4]。在任何一种情况下，每个模块的酶功能确定性地编码最终产物的化学性质[5]。
脂肪酸合成酶（FAS）是一种PKS巨型合成酶
PKS的生物合成基础与FAS的基本相同。尽管FAS严格完全降低（图1b），但β碳修饰的性质和程度在PKS中有所不同[6]。虽然PKS的知识在过去十年中得到了改善[7]，特别是在最近的结构研究[8-10]的帮助下，目前对PKS的深入了解仍然建立在FAS数据的基础之上。自FAS研究开始以来，Bloch，Lynen，Stadtman和Wakil的开创性研究[10-12]，FAS一直受到激烈的调查，今天对此有了比较了解。近年来，关于FAS多酶复合物（I型）的大量结构数据进一步加深了对脂肪酸（FA）合成原理的深入了解[13-19]。
FAS / PKS作用模式的分子机制
划分
区室化是FAS和PKS系统中都看到的一种现象，但它的具体结构表现不同。在真菌FAS（和在放线菌属的棒状杆菌，分枝杆菌和诺卡氏菌中发生的细菌I型FAS ）中，自然进化出了一个由2.6 MDa组成的D3对称桶状结构，其包围了两个反应室中的所有合成过程（图2a）[ 19,20]。动物FAS表现出结构上开放的同源二聚体折叠，显示出高的构象灵活性，允许大摆动和旋转运动（图2b））。在动物FAS中，FA的合成在反应裂缝中进行，而不是在真菌FAS中发现的封闭室中进行。
从真菌FAS的尺寸（桶形结构抽象为圆柱体并考虑每桶六个完整的活性位点）的近似计算表明1.8mM活性位点的虚拟浓度。对动物FAS的类似考虑（再次抽象为跨越圆柱形反应空间，两组完整的活性位点）给出1.2mM的虚拟活性位点浓度。因此，FA I型合成的两种支架促进酶结构域的高虚拟浓度下的反应。PKS megasynthases与哺乳动物FAS折叠共享基本原理（图2c）[6,7]，假设活性位点浓度处于相似范围内是有效的。细菌和线粒体FA合成包含单独的酶。为了补偿较低的组织水平，关键酶在约10,000（丙二酰转移酶FabD）至23,000（脱水酶FabA）的拷贝数下发生，因此在大肠杆菌中最丰富的蛋白质类别中表示; 在核糖体蛋白质和与翻译相关的蛋白质后直接浓度[21]。用大肠杆菌细胞的平均体积2.5μm [3,22]计算，拷贝数为约0.007-0.016mM的摩尔浓度。
基板穿梭
FA和PK合成通常依赖于ACP，其将底物和中间体作为共价结合的货物在活性位点之间穿梭[23]。在FAS和PKS（I型）巨型合成酶中，ACP作为结构域嵌入大多肽链中（图2a和b）。ACP保持在隔室中，阻止共价连接的酰基部分的损失，实现高底物浓度。除了模块内基质穿梭，ACP还负责将模块PKS中的货物转移到下游模块，这很大程度上解释了这些蛋白质的装配线特性（图2c）。
作为多酶区室的一部分，ACP作用的模式被最好地描述为在受ACP接头和蛋白质支架限制的构象空间内实现有限扩散。根据报道的2,500 mU / mg [24]的比活度计算，酿酒酵母 FAS每秒运行约18次迭代循环（每组活性位点）。鉴于每个循环需要ACP和催化结构域之间的六个生产性相互作用（ACP：KS（ping-step）→ACP：MTP→ACP：KS（pong-step）→ACP：KR→ACP：DH→ACP：ER） ，酿酒酵母FAS每9.2毫秒执行一次催化步骤。这种高催化效率是由于真菌FAS的高度进化开发的结构。酶结构域刚性地嵌入反应室的壁中，而ACP结构域通过两个长度为约20至50个氨基酸残基的非结构化接头（酿酒酵母 FAS中的40和25个氨基酸）保持在室中央。有趣的是，在某些真菌FAS中观察到重复的ACP结构域，并且ACP重复在进化过程中被列为相当晚的事件[25]。鉴于ACP在基质穿梭中的关键作用，多个ACP结构域可能有益于增加进行I型合成的底物浓度[26,27]。根据鸡FAS报告的特定活动计算，构象上更灵活的哺乳动物FAS以每秒2个周期（每组活性位点）运行[28]。由于难以获得纯化的蛋白质，有限数量的研究报道了PKS巨型合成酶的活性。例如，模块化PKS 6-脱氧红霉内酯B合酶（DEBS）在产品生产的六个延伸步骤中显示出约1分钟-1的转换数（因此每组活性位点每秒大约0.05个伸长）[29]。对于迭代的PKS 6-甲基水杨酸合成酶（MSAS），转换数约为4.2 min -1报告了产品合成的三次迭代（每组活性位点每秒0.1个伸长率）[30]。
ACP的功能
目前，ACP作用模式的分子细节通过结构，功能和计算方法进行协同解码，揭示了基板穿梭的图片不仅仅是保持基板在合成单元中招募的手段。关于ACP与催化结构域的相互作用的大多数理解再次源于对FAS的研究。酿酒酵母 FAS X射线结构收到早期信息，其中发现ACP与KS结构域接触[31]。在真菌FAS中，ACP是由细菌样核心折叠和4-螺旋延伸折叠组成的延伸折叠，使得ACP大约是哺乳动物FAS和PKS中发生的ACP大小的两倍。活性丝氨酸，是翻译后磷酸泛酰巯基化的[24,32]，位于折叠的与N-和C-末端连接位点相对的末端。该结构组织可能保留接头干扰ACP：结构域相互作用，并且伴随地，可以通过将酰基尾部引导至结合通道来支持共价酰基部分的加载。基于酿酒酵母 FAS数据的计算研究通过在促进正确取向的意义上确认转向以及通过电荷互补性建议静电转向来改进对ACP介导的酿酒酵母 FAS中的底物穿梭的理解。有约束力的伙伴的表面[33]。最近的研究已经表明FAS megasynthases的ACP不能隔离共价结合的酰基部分，这支持了底物穿梭的分子转向效应[34,35]。关于ACP与催化结构域的相互作用的具体结构信息是罕见的，受到该事件的瞬时性质的阻碍。特定交联剂的应用有助于克服ACP与FAS II型脱水酶FabA相互作用的困难[36,37]。该研究首次追踪ACP对接和酰基部分结合的关键事件，并且允许初步了解ACP底物递送的动态过程。ACP VinL和酰基转移酶VinK的相互作用，参与加载PKS megasynthase，最近在结构[38]中解决。可以合理地假设PKS中的ACP作用模式类似于FAS。然而，ACP在模块化PKS中的作用由于将酰基部分也输送到下游模块的额外任务而变得复杂（图2c）。只提供关于这种易位步骤性质的基本信息; 最重要的是，建议ACP在内部和内部的酰基链递送期间与不同的面对接[39,40]。
megasynthase工程的策略
一个多酶模块的概念负责将一个构建模块整合到模块化系统中，这使得化学家和生物学家二十多年来一直致力于为生物活性化合物的定向合成创建工程管道[41,42]。megasynthases的工程提供了用可持续的绿色化学方法补充或替代天然化合物生产的合成化学策略的机会。关于PKS工程的几篇报道证明了该概念的可行性[43,44]，但是megasynthase设计作为天然化合物或复杂前体分子的定制合成的工具迄今仍然难以捉摸[45,46]。
为了通过设计相应的megasynthase来产生PK的理想目标，化学/生物学界已经在很大程度上执行了从可互换单元组装模块和域的方法。主要通过添加，去除和/或取代模块和结构域（图3a），已经生成具有不同模式的官能团的化合物库[1,47-50]。鉴于ACP在模块内和模块间相互作用过程中的复杂作用的新兴知识，以及模块 - 模块相互作用的基本不明确的原则[8,51,52]，通过这种嵌合装配线PKS进行无阻碍的矢量运输的想法可能看起来很幼稚。显然，过去二十年的研究表明，模块和域本身不可互换[45,46]，成功的混合和匹配方法将显着依赖于工程冲突接口。