酶促制备加帽的mRNA

封端mRNA的酶促制备基于DNA模板的体外转录（IVT）。虽然通过固相合成合成的RNA在其最大长度上受到限制，但是通过IVT可以容易地制备长度为几千个核苷酸的RNA。另一方面，酶促产生的RNA的长度通常是不均匀的，对于短RNA，纯化后获得的产量可能很低。这阻碍了酶的产生具有确定长度的短RNA，用于需要限定和同源RNA种类的应用。IVT产生未加帽的5'-三磷酸化RNA，但有两种获得带帽的mRNA的策略，将在以下章节中详细讨论。

转录后加帽

在转录后加帽中，来自IVT的RNA经历专用的酶促加帽反应。体外使用的酶来源于不同真核生物或DNA病毒的加帽装置，可以在大肠杆菌中 重组产生[28,29]。Cap0的酶促形成包括靶向新生5'-三磷酸化前mRNA的三个连续反应（图1）。首先，5'-三磷酸酶（TPase）水解前mRNA的γ-磷酸。接下来，将得到的5'-二磷酸末端的β-磷酸与GMP偶联，形成5'-5'-连接的Gppp-RNA。负责任的鸟苷酸转移酶使用GTP作为底物并形成共价酶 - （赖氨酰-N）-GMP中间体，使人联想到DNA连接酶-AMP中间体[30,31]。最后，使用S-腺苷-L-甲硫氨酸（AdoMet）作为共底物，通过RNA（鸟嘌呤-N 7）甲基转移酶在N 7位甲基化帽结构[31]。

在自然界中，一旦转录物达到20-30个核苷酸的长度，这些加帽酶就会共转录[32]，这可以通过它们募集到RNA聚合酶II的C末端结构域来实现[33]。在高等真核生物中，cap1和cap2结构分别通过相邻第二和第三核糖的2'-羟基的后续甲基化产生[34]。

如Rosenberg小组的开创性工作所述，这些加帽酶 - 例如来自痘苗病毒 - 可以通过将它们和它们各自的共底物添加到IVT反应中而被用于体外生产加帽RNA [35]。迄今为止，来自痘苗病毒的加帽酶是商业上可获得的并且最广泛地用于转录后体外加帽。它们由两种病毒蛋白D1和D12组成。三磷酸酶和鸟苷酸转移酶活性位于大的D1蛋白的C末端一半的N-末端和甲基转移酶，而小的D12蛋白没有催化活性但激活D1 [36-38]。

最初，据报道用牛痘盖帽装置加盖RNA的效率很低[35,37,39,40]。迄今为止，该酶是商业上可获得的，然而，以μmol规模生产加帽RNA所需的酶量阻止了其普遍适用性[41]。对于痘苗病毒加帽酶在大规模5'-加帽RNA生产中的应用，Fuchs等。最近报道了牛痘酶的表达和纯化方案，与商业上可获得的加帽方法相比，允许以更具成本效益的方式大量加帽[41]。

使用可商购的痘苗蛋白mRNA帽2'- O-甲基转移酶可以实现转录后加帽以获得具有cap1结构的mRNA [42,43]。另外，可以用市售的mScript TM系统产生真正的mRNA，该系统结合了T7 RNA聚合酶，三官能加帽酶，2'- O-甲基转移酶和聚（A）聚合酶。虽然价格昂贵，但该系统允许在一锅中产生mRNA，具有所要求的定量产率和高翻译活性。

非天然帽类似物的转录后制备通过以松弛的底物特异性限制酶来实现。例如，利巴韦林通过牛痘盖帽酶用作底物，并且可以转移到RNA转录物的二磷酸酯末端上以形成利巴韦林-pppN结构。用利巴韦林封闭的RNA转录物显示出很小的翻译效率，这可以解释利巴韦林的抗病毒活性[44]。使用由Bisaillon及其同事[45]模型生物草履虫小球藻病毒-1（PBCV-1）的加帽酶实现了GTP类似物的帽类似物的酶促形成。。在该研究中测试的22个核苷酸类似物中，发现13个与PBCV-1鸟苷酸转移酶（GTase）形成共价复合物，而11个实际上转移到5'-二磷酸RNA上（图2）。此外，当替代修饰能够与eIF4E结合时，即使在不存在N 7 - 甲基的情况下，用这些核苷酸类似物封端的RNA也被翻译[45]。