共转录加帽

在共转录加帽中，将帽类似物直接添加到IVT中。它们通过具有松弛底物特异性的RNA聚合酶在5'-末端掺入（例如，T3，T7或SP6 RNA聚合酶）直接产生相应的5'-加帽的mRNA（图3）。由于帽类似物缺乏游离的5'-三磷酸，因此在IVT期间不会发生帽类似物的内部掺入。

最常用的帽类似物是m 7 GpppG，但RNA聚合酶也接受几种修饰的或替代的帽类似物。因此，该途径可用于在5'末端安装非天然二核苷酸，可进行进一步的化学反应[46]。

共转录加帽的一个经常被忽略的限制是，并非所有从IVT获得的mRNA都被限制，仅仅因为帽类似物与GTP竞争作为引发核苷酸。重要的是，封端/未封端的mRNA的比例通常在凝胶上不可见。通过降低GTP浓度或通过用5'-多磷酸酶消化未加帽的（即三磷酸化的）RNA可以减轻该问题，所述5'-多磷酸酶产生单磷酸化RNA，然后进行5'-磷酸依赖性外切核酸酶消化。

m 7 GpppG作为引发剂遇到的另一个问题是伸长到“错误”方向，即在m 7 G 的3'-OH处，产生具有反向取向的帽的mRNA（图3）。高达一半的mRNA可以包含反向的帽，不会被翻译[47]。通过开发在N 7 - 甲基鸟苷核糖（m 2 7,3'- O GpppG或m 7,3'-d）的3'-OH处甲基化或脱氧的抗反转帽类似物（ARCA）解决了该问题。GpppG）。这可以防止“错误的”3'-OH伸长，因此ARCA盖子只能以正确的方向加入[48,49]。有趣的是，在m 7 G 的2'位置的修饰也阻止了帽类似物的反向掺入[50]。当GpppA帽类似物与T7 II类启动子phi2.5组合使用时，可以避免定向问题，其允许用ATP启动RNA合成。因此，可以产生GpppA-或m 7 GpppA-加帽的RNA [51]。当使用常见的GTP起始T7 III类启动子phi6.5时，GpppA以其反向方向掺入，产生ApppG加帽的mRNA，其在生物学上不具有活性。

由于噬菌体RNA聚合酶对G或A的严格偏好，取决于启动子，不能使用体外转录制备在5'末端以U或C开始的人工mRNA，这限制了例如结构分析中的可能应用。

短RNA片段的共转录加帽

为了制备短，加帽的RNA的与序列GpppAN Ñ或米7 GpppAN Ñ（1≤ ñ ≤9 NT），噬菌体T7基因4引发酶[52]或它的活性结构域[53]可被使用。Primase将帽子类似物专门用于正确的方向。通常，来自T7噬菌体的基因4引物产生具有来自DNA模板的序列pppAC的短RNA。Matsuo等。观察到GpppA或m 7 GpppA可以与ATP一样有效地掺入第一个核苷酸[52]。作为第一核苷酸的腺苷的基因4引物的底物特异性阻止GpppA以其反向方向掺入并且完全掺入GpppG。该方法用于生产同位素标记的加帽RNA用于cap-eIF4E NOESY-NMR研究[52]。Peyrane等。表明使用具有初始活性的N-末端片段导致RNA的制备产量相当，同时片段的表达和溶解度得到改善[53]。