mRNA帽类似物

帽类似物的制备

上述共转录加帽需要制备加入转录反应中的帽类似物。理想情况下，这些帽类似物应符合以下标准：（i）加入IVT时的高掺入效率，（ii）掺入RNA时的正确方向，（iii）与帽结合蛋白eIF4E的强结合，（iv）抑制潜力当在体外翻译测定中作为竞争剂加入时和（v）所得加帽RNA的高翻译效率。图4A描绘了标准帽类似物m 7GpppG（12）和GpppG（14）的结构。m 7 GpppG 的合成始于鸟苷二磷酸（GDP，15）和鸟苷一磷酸（GMP，16，图4B），它们都可以通过鸟苷的磷酸化获得[54]。GDP的甲基化使得m 7 GDP（17）具有高产率和区域选择性[55]。帽类似物合成的关键步骤是形成三磷酸酯键。已经报道了多种策略，其主要依赖于相同的原理：两种核苷酸中的一种（通常是单磷酸化的核苷酸）配备有良好的离去基团而另一种充当亲核试剂。已经开发了不同的离去基团用于合成帽类似物，包括苯硫基[56]，5-氯-8-喹啉[57]。，吗啉酸[48]和咪唑化物部分[58,59]。Sekine等人首次报道了在ZnF 2中在DMF中的咪唑活化。[60]并且是最常用的形成三磷酸盐的方法。已知P-咪唑与许多亲核试剂如核苷单 - ， - 二 - 或 - 三磷酸反应，并且通常在氯化锌存在下在无水DMF中反应。在ZnCl 2作为催化剂存在下，GMP咪唑啉（18）与m 7 GDP（17）反应，得到m 7 GpppG（12）[49]。

在过去几年中，使用这种一般合成策略的变体来获得许多帽类似物。最有趣的改进之一是上面提到的抗反转帽类似物（ARCA）和GpppG，它们是可商购的。此外，已经开发出具有改进性质的帽类似物 - 即与eIF4E的结合，翻译效率和核酸酶抗性。此外，帽类似物具有治疗潜力，如许多帽衍生的翻译抑制剂[61-63]所证明的。

新型帽类似物的应用

寻找具有改进性能的新型 - 非天然或改性 - 帽已经取得了可喜的成果。用锁定核酸（LNA）修饰的二核苷酸帽类似物封端的RNA 比常规m 7 G-封端的RNA 翻译效率高3倍[64]。另外，发现用LNA帽类似物封端的RNA在培养细胞中的荧光素酶测定中比具有标准帽的相应RNA更稳定约1.6倍。然而，在本研究中，没有评估该LNA帽模拟物与已建立的ARCA帽相比如何表现。有趣的是，含有m 7的3'- O-炔丙基与标准帽相比，GpppG帽类似物也显示出高出3倍以上的翻译效率。帽类似物专门用于正确（向前）方向，分子模拟研究表明，与标准帽相比，炔丙基修饰帽与eIF4E的结合更强[65]。

关于翻译活性，在体外研究中显示几种含有四磷酸的二核苷酸帽类似物优于常规三磷酸[66]。用m 7 Gp 4 m 7 G 封端的RNA 翻译效率提高3倍以上。有趣的是，在体外翻译实验中，苄基修饰的四磷酸酯帽类似物也显示出高出2倍以上的翻译。在进一步的步骤中，制备具有亚甲基（二膦酸盐）部分的四磷酸盐，其改善了与eIF4E的结合，并且在一些情况下赋予了对DcpS降解的酶促抗性[67]。N 2在翻译抑制试验中，显示含有三唑的单磷酸酯帽类似物与m 7 GpppG 一样有效[68]。

可以在磷酸盐部分中进行进一步的修饰。在β-位置被硫原子取代的ARCA封闭的RNA显示出对来自粟酒裂殖酵母的Dcp1 / 2脱帽复合物的抗性，同时对eIF4E显示出高亲和力并且当掺入RNA时具有翻译活性[69] ，70]。使用一系列1,2-二硫代二磷酸帽类似物进一步改善了这些性质，其中一些类似物在掺入mRNA并在树突细胞中应用时显示出显着改善的稳定性[71]。

此外，合成了提供额外功能的帽类似物。制备含有6-硫鸟嘌呤的光交联帽类似物，其允许选择性交联[72]。成功交联的例子是用6-硫鸟甙帽类似物封端的组蛋白H4 mRNA的链内交联。用2'-NH 2 -修饰的帽类似物实现生物素标记的帽的合成，所述帽类似物与N-羟基琥珀酰亚胺生物素活性酯反应[73]。生物素标记的帽类似物可以在IVT期间掺入mRNA中，并在体外翻译测定中保持与eIF4E的结合和翻译活性。

除了用于通过IVT制备帽修饰的RNA之外，帽类似物已经找到了替代应用。由于帽结合蛋白（例如，eIF4E和DcpS）对帽类似物具有高亲和力，用帽类似物m 7 GTP 功能化的树脂可用于从分级细胞裂解物中纯化结合蛋白[74-76]。使用m 7 G-修饰的琼脂糖凝胶树脂，可以鉴定出新的帽结合蛋白如gemin-5 [77]。亲和树脂可以通过亚甲基部分稳定，防止帽类似物的酶促降解[78]。

近年来，通过干扰eIF4E-RNA帽相互作用，帽类似物开始被认为是翻译的抑制剂。在肿瘤发生中，eIF4E的致癌活性归因于其激活翻译的能力[79]。此外，其长期被用于体外的eIF4E抑制标准帽类似物[80] ，所述的前体药物4Ei-1轴承的Ñ 7-苄基部分被证明是帽依赖性翻译的斑马鱼的有效抑制剂[81] 。通过与腺病毒样颗粒偶联可以避免对帽类似物的细胞摄取不良，从而在大鼠模型中抑制肝细胞癌的生长[82]。。最近，在其5'末端制备了带有正构eIF4E抑制剂的人工加帽RNA [83,84]。通过表面等离子体共振（SPR）测量，具有该帽替代物的RNA保持与eIF4E的结合。该工作为在5'末端引入其他人工帽类似物提供了基础，旨在调节所得RNA的生物活性。

化学合成的帽类似物的酶促修饰

帽类似物的完全化学合成的替代方案是使用酶来官能化标准帽类似物。该方法受益于酶的特异性，因此功能部分直接引入mRNA帽的限定位置。在过去几年中，我们小组开发了在N 7和N 2位置进行修饰和功能化的化学酶策略。酶促修饰基于甲基转移酶，其自然地将甲基从其共底物S-腺苷-L-甲硫氨酸（AdoMet）转移至靶分子[85]。如果可获得适当的混杂甲基转移酶，则可以从AdoMet类似物转移功能化侧链[86]。重要的是，必须在锍中心的β-位置存在不饱和键，这稳定了AdoMet类似物酶促转移过渡态[87]。

来自原生动物贾第虫（Giardia lamblia）的三甲基鸟苷合成酶GlaTgs2的工程化产生变体（V34A），其容纳具有较大侧链的AdoMet类似物并将各种功能部分（包括炔丙基，戊烯基，叠氮基-2-烯基和4-乙烯基苄基）转移至N 2。 - 加帽的RNA或mRNA帽类似物的位置，例如m 7 GpppA，m 7 GpppG或m 7 GTP（图5A）[88-91]。最近，我们揭示了来自Encephalitozoon cuniculi的N 7-cap甲基转移酶Ecm1非常混杂。载有例如降冰片烯或4-乙烯基苄基部分的空间非常苛刻的AdoMet类似物被有效转化[92,93]。明显的杂乱性可归因于Ecm1的结构，其形成底物结合裂口而不是口袋[94]。

乙烯基苄基修饰的帽类似物（在N 7或N 2位置处具有修饰）提供了用于与四嗪缀合物反向电子需求Diels-Alder反应和使用四唑的光点击反应的平台。即使光交联基团酶法转移到Ñ从合适的AdoMet类似物的mRNA帽的7位上。值得注意的是，实现了N 7位的定量修饰[96]。二氮杂萘和芳基叠氮化物光交联剂部分是功能性的，显示与帽结合蛋白eIF4E的交联。微尺度热泳显示这些交联剂修饰的帽仍然与eIF4E结合，尽管亲和力强烈降低。翻译是很容易受到在该修改Ñ的mRNA帽的7位上。虽然Ñ 7-烯丙基或ñ 7- azidobutenyl修改在体外没有观察到翻译活性，在Ñ 7-苄修改显示的残留活性。这可能归因于eIF4E结合口袋中色氨酸之间的苄基部分的堆积[63,66,97]。

在N 2 - 和N 7 - 位置的酶促修饰也可以组合以产生双修饰和双修饰的帽类似物。Tgs-酶对N 2 - 位置的修饰取决于鸟嘌呤N 7位的甲基化，这导致正电荷。然而，GlaTgs活性依赖于正电荷而不是甲基本身，例如研究表明N 7 - 乙基和N 7 - 苄基 - 修饰的帽类似物仍然是GlaTgs的底物[98]。这使我们能够酶促制备具有不同功能部分组合的帽类似物（图5B）[95]。4-乙烯基苄基/叠氮基双重修饰允许添加两种不同的荧光染料，其可以作为FRET对应用。在这种情况下，在两个生物正交反应，即iEDDA和SPAAC反应中实现标记。此外，具有叠氮基和炔烃功能的双重修饰使得能够使用SPAAC和CuAAC反应的组合进行荧光团/生物素标记。基于最近报道的酶促级联反应，也可以实现用炔部分有效双标记mRNA帽[99]。在该系统中，Se-丙炔基修饰的AdoMet类似物（SeAdoYn [100]通过甲硫氨酸腺苷转移酶变体（MAT-Var。）从相应的甲硫氨酸类似物和ATP酶促制备。AdoMet类似物直接被甲基转移酶转化，产生双炔改性的帽类似物[95]。