加帽mRNA的化学合成

固相合成加帽的RNA

加帽RNA的化学合成基于RNA的固相合成，然后化学或酶促安装5'-帽。固相RNA合成的一般原理超出了本综述的范围，并已在优秀的综述文章[101-104]中进行了描述。迄今为止通过固相化学合成的最长RNA具有170个核苷酸的长度，并且用2-氰基乙氧基甲基（CEM）作为2'-OH保护基团制备[105]。

最初报道溶液中5'-封端的RNA的化学合成是低产率，慢的（反应时间为6-10天），并且不适合大规模制备[58,106-110]。从那时起，几个小组通过固相合成改进了加帽RNA的化学合成。高碱不稳定的m 7 G部分证明是一个限制因素，因为它与标准的固相脱保护方案不相容。由于其正电荷，m 7 G部分在水解上不如其他嘌呤核苷稳定。在通常用于RNA去保护和从固体支持物上切割的基本条件下，会发生7-甲基鸟嘌呤的咪唑环的开放[111]。。因此，为了在固体载体上合成帽结构，不可能用氨进行标准的脱保护。

Sekine在2001年报道了通过固相合成制备的封端RNA的早期实例[112]。甲2,2,7- trimethylguanosine（TMG）加帽U1 snRNA的三核苷酸的块与该结构米3 2,2,7- ģ 5' pppAm 2'庵2'按如下制备，从合成的5'-磷酸化的三聚体开始通过标准的亚磷酰胺化学。解决m 7的问题在碱性条件下G不稳定性，TMG-加帽反应在所有碱不稳定基团脱保护后进行。将新的酸不稳定接头用于固体支持物允许随后释放RNA。然而，由于总体低的偶联效率和分离的产率（在阴离子交换色谱后该化合物以20％的总收率分离），该方法不用于大规模合成加帽的RNA（图6A））。由于低反应产率主要由三磷酸桥的多步制备引起，Sekine组呈现了在固体支持物上具有5'-末端TMG-封端的焦磷酸酯键的RNA的合成途径。由于焦磷酸盐的形成比三磷酸盐的形成更容易，因此该途径导致更高的偶联产率。这种RNA是否仍具有生物活性仍有待证实[113]。此外，这些加帽方法可用于产生生物学相关的RNA。通过酶促连接含有三甲基化m 3 2,2,7的短RNA（10nt长）制备U1snRNA。G cap部分为通过IVT产生的154nt长RNA。还生产了具有焦磷酸桥联TMG帽的各个U1snRNA和含有乙二醇键的TMG帽[114]。

与IVT不同，固相合成提供了在特定位置引入修饰核苷酸的灵活性。复杂的锥虫cap4结构的化学合成，其特征在于前四个核苷酸的2'- O-甲基化和第一个腺苷和第四个尿苷的额外甲基化，由Darzynkiewicz 组在2004年报道。通过使咪唑活化的m 7 GDP与5'-磷酸化的四聚体[115]反应来实现制备。该帽成功用于锥虫cap4相互作用蛋白的亲和纯化[116,117]。

Nagata等。报道了基于化学合成的RNA链的第一次成熟mRNA的制备，其显示在细胞中具有生物学活性[105]。这是通过结合固相合成和酶促修饰来实现的。具体地，化学合成5'-二磷酸化的RNA（长达170nt长），从固体支持物上切下，去保护和纯化。然后进行酶促封端，2'- O-甲基化和聚腺苷酸化。

Thillier等人也使用化学合成和酶促修饰的组合。用于大规模合成加帽RNA。在此，为了避免m 7 G不稳定性的问题，首先使用亚磷酰胺2'- O-新戊酰氧基甲基法合成非甲基化的加帽RNA ，然后使用人（鸟嘌呤-N 7） - 甲基转移酶进行酶促N 7甲基化（图6B）。cap1结构也可以通过末端核苷酸[111]的 2'-OH甲基化获得。这种方法与其他组合作应用于生产和研究加帽RNA [118]。

总之，新的化学加帽策略能够以高产率制备加帽的RNA并且不依赖于序列，从而提供不能通过IVT制备的RNA的途径。然而，通常数千个核苷酸长的生物相关mRNA的制备不是直接可行的，因为迄今为止最长的化学制备的RNA包含170个核苷酸。结合化学和酶制备加帽RNA的方法具有解决这些限制的潜力，并将在下面描述。

结合化学和酶学方法：引物延伸