蛋白酶的快速消化限制了肽作为治疗剂的应用。增加肽的蛋白水解稳定性的一种策略是用氟化氨基酸修饰。该研究提供了氟化亮氨酸和异亮氨酸衍生物对肽的蛋白水解稳定性的影响的系统研究，所述肽被设计为包含不同蛋白酶的底物特异性。因此，亮氨酸，异亮氨酸及其侧链氟化变体位点特异性地掺入该肽的不同位置，产生13种不同肽的文库。研究了这些肽对α-胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶K和弹性蛋白酶的蛋白水解的稳定性，并且该过程之后进行FL-RP-HPLC测定并结合质谱法。在少数情况下，我们观察到在引入氟取代基时蛋白水解稳定性的异常增加。在其他情况下观察到相反的现象，这可以通过氟化残基与相应酶结合位点的特异性相互作用来解释。值得注意的是，当位于切割位点的N-末端时，5,5,5-三氟异亮氨酸能够显着保护肽免于蛋白质水解而被本研究中包括的所有酶。这些结果为氟化氨基酸在蛋白水解稳定的基于肽的药物的设计中的应用提供了有价值的信息。这可以通过氟化残基与各酶结合位点的特异性相互作用来解释。值得注意的是，当位于切割位点的N-末端时，5,5,5-三氟异亮氨酸能够显着保护肽免于蛋白质水解而被本研究中包括的所有酶。这些结果为氟化氨基酸在蛋白水解稳定的基于肽的药物的设计中的应用提供了有价值的信息。这可以通过氟化残基与各酶结合位点的特异性相互作用来解释。值得注意的是，当位于切割位点的N-末端时，5,5,5-三氟异亮氨酸能够显着保护肽免于蛋白质水解而被本研究中包括的所有酶。这些结果为氟化氨基酸在蛋白水解稳定的基于肽的药物的设计中的应用提供了有价值的信息。
关键词： 氟化氨基酸; hexafluoroleucine; 肽类药物; 蛋白酶稳定性; trifluoroisoleucine
基于肽的药物是有前途的药物，因为它们具有几个优点，包括高选择性，特异性和识别和结合其靶标的功效[1-6]。然而，由于口服生物利用度低和半衰期短，部分归因于消化系统和血浆的蛋白酶[1-8]，它们作为药物的应用往往受到限制。已经开发出克服这些限制的有效方法，包括掺入非天然氨基酸，例如D-氨基酸，骨架延伸或化学修饰的氨基酸[1]。在这方面，将氟掺入氨基酸已成为一种有前途的策略。氟的独特性质，即低极化性，强诱导效应和高电负性，以及其小尺寸，导致强的短C-F键并扰乱相邻官能团的酸性和碱性。此外，这些变化可能强烈影响氢键和静电相互作用，这对于与受体结合或在蛋白酶稳定性的情况下对酶是至关重要的。因此，当以氟化氨基酸的形式引入时，这种独特的元素可以改变蛋白质和肽的生物物理，化学和药物特性，包括它们与蛋白酶的相互作用[9,10]。
几个实验室专注于引入高度氟化的疏水氨基酸类似物，并研究了所得蛋白质对热和化学变性的稳定性的影响[9,11-22]。这些研究促使进一步研究氟化氨基酸在多大程度上稳定肽和蛋白质，尤其是蛋白水解降解。Meng和Kumar报道，将5,5,5,5'，5'，5'-六氟亮氨酸（HfLeu）掺入抗菌肽magainin 2 amide和buforin可增强其对胰蛋白酶蛋白水解降解的抵抗力[23]。他们还将HfLeu引入胰高血糖素样肽-1（GLP-1），这是一种有吸引力的先导化合物，用于治疗2型糖尿病。不幸的是，野生型肽的临床应用受到严重阻碍丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶快速消化（≈2分钟）[24-26]。令人满意的是，氟化GLP-1类似物对该酶显示出更高的蛋白水解稳定性[27]。
通常，与母体非氟化肽相比，氟化肽的增强的蛋白水解稳定性通过其更大的疏水性和改变的二级结构来解释。另一个原因是氟化氨基酸的空间体积增加，这意味着蛋白酶降解的保护是肽从活性位点空间封闭的结果[23,28]。相比之下，Marsh实验室发现将HfLeu引入抗菌肽MSI-78只能使其在脂质体存在下对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白水解更稳定[29]。在没有脂质体的情况下，氟化变体与非氟化对照一样快速降解，这表明HfLeu的掺入不是阻止肽被蛋白酶消化的唯一因素[29]。还研究了氟化芳族氨基酸对肽蛋白水解的影响。例如，将单氟化苯丙氨酸变体掺入组蛋白乙酰转移酶蛋白tGN5导致胰凝乳蛋白酶消化测定中的去稳定化[30]。在南极假丝酵母的糖基化缺陷突变体中替换色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基脂肪酶B，CalB N74D，通过其单氟化类似物，使蛋白酶K对蛋白水解降解的抗性保持不变[31]。加入α-氟烷基取代的氨基酸也可以产生蛋白水解稳定的肽，蛋白酶甚至可以用于合成α-氟烷基取代的肽[32-38]。
这些结果表明氟化氨基酸对肽和蛋白质的蛋白水解稳定性的影响仍然难以预测。为了系统地研究氟化氨基酸对肽的蛋白水解稳定性的影响，我们组中预先设计了10个氨基酸的肽（FA），包括蛋白酶α-胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的底物特异性[39， 40]。2-氨基丁酸（Abu）及其氟化类似物2-氨基-4,4-二氟丁酸（DfeGly）和2-氨基-4,4,4-三氟丁酸（TfeGly）分别掺入P2，P1 '或P2'的位置[41]给出九种不同的FA类似物。在先前的研究中，我们观察到氟原子引入Abu侧链可以显着改善或显着降低不同酶和人血浆对水解的抵抗力，这取决于侧链的氟含量，取代相对的位置。到切割位点和特定的蛋白酶[39,40]。
在这里，我们将这些研究扩展到包括高度氟化，空间要求高的HfLeu和5,5,5-三氟异亮氨酸（TfIle），并研究它们对丝氨酸蛋白酶α-胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶和蛋白酶K的蛋白水解稳定性的影响，以及天冬氨酸蛋白酶胃蛋白酶。