肽的设计和结构 - 化合物定制合成网

为了阐明氟化对蛋白水解稳定性的影响，我们先前设计了肽FA（图1b），其包含α-胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶[39,40]的底物特异性。因此，P1位置被苯丙氨酸残基占据。在肽序列的两端引入赖氨酸残基以增强溶解度，并且N-末端的邻氨基苯甲酸（Abz）用作荧光标记。位置P3，P3'和P4'中的丙氨酸残基充当间隔物，因为肽以延伸的构象与酶的活性位点结合[42]。切割位点处或附近的位置P2，P1'和P2' [41]携带用于通过蛋白酶识别底物的关键残基并用作取代位点。

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图1：（A）异亮氨酸（结构研究1），亮氨酸（2它们的氟化类似物5,5,5），和-trifluoroisoleucine（3，TfIle）和5,5,5,5' ，5' ，5' -六氟亮氨酸（4，HfLeu）。括号中给出的范德华体积对应于侧链（从α-碳开始），并根据Zhao等人计算。[43] ; （b）研究的肽的名称和氨基酸序列; 替换位置标记为Xaa; Xaa = Leu，HfLeu，Ile或TfIle。职位根据Schechter和Berger命名法命名[41]。

P2，P1'或P2'位置的丙氨酸分别用TfIle或HfLeu取代（图1a）。Ile和Leu变体也作为非氟化对照包括在该研究中。这导致了12个FA变体库（图1b）。

Leu和Ile比Ala更大且更疏水。氟化氨基酸比它们的烃类似物更大且更疏水[44,45]。此外，已经证明氟取代会使邻近的C-H键（这里是γ-氢）极化，从而影响非共价相互作用[9,11]。由于此处使用的氨基酸（图1a）的氟化程度，空间需求和疏水性不同，预计它们对酶的结合口袋具有不同的影响，这反映在蛋白水解测定中的不同行为。

蛋白水解稳定性的测定

将所有肽与四种不同的蛋白酶一起温育，并在24小时内进行蛋白水解降解。α-胰凝乳蛋白酶[46-49]和胃蛋白酶[50-54]都是充分表征的消化蛋白酶。它们与胰蛋白酶一起是人体消化系统的主要酶。弹性蛋白酶对非芳香族中性侧链具有广泛的底物特异性[55,56]，存在于人胰腺和血清中。蛋白酶K是一种广泛用于蛋白质灭活和降解研究的酶，因为它具有广泛的底物特异性和高活性，因此即使在洗涤剂存在下也能消化多种天然蛋白质[57]。。这四种酶在其亚位点具有不同的偏好，从而为我们的研究提供了广阔的空间。

通过荧光检测的分析型HPLC测定法表征蛋白水解消化过程[39,40]。为了定量底物降解，进行相应HPLC峰的积分。通过ESI-ToF质谱法鉴定裂解产物（参见支持信息文件1，表S4-S7）。图S2（支持信息文件1）显示了所有消化实验的时间进程。以下部分给出了各酶的结果的详细描述。

对α-胰凝乳蛋白酶的蛋白水解稳定性（EC 3.4.21.1）

α-胰凝乳蛋白酶是具有广泛特异性的丝氨酸内肽酶。它优选在P1位置切割C-末端的肽键到大的疏水残基，例如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸和亮氨酸。二次水解也发生在异亮氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，组氨酸，甘氨酸和丙氨酸的羰基末端[47,58-60]。

α-胰凝乳蛋白酶的S2亚位点通常更喜欢容纳疏水残基[59,61]。我们观察到氟化P2变体在120分钟后与其烃类似物相比显示较少量的消化，而所有变体比对照FA更稳定（图2））。24小时后，除P2-LeuFA外的所有P2肽仍然比FA更稳定。与FA相比，将Leu掺入P2导致完全蛋白水解，其中Ala占据该位置。然而，将六个氟取代基掺入Leu（产生HfLeu）导致蛋白水解稳定性几乎100％的增加。Ile在P2中不像Leu那样高度优选，但是在这里引入三个氟取代基导致稳定性增加50％。P2-HfLeuFA和P2-TfIleFA完全没有被消化，这表明HfLeu和TfIle在α-胰凝乳蛋白酶的S2口袋中不受青睐。

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图2：在30mM的10mM磷酸盐缓冲液（pH7.4 ）中用α -胰凝乳蛋白酶孵育120分钟（左）和24小时（右）后剩余的底物百分比。显示的数据代表三次独立测量的平均值。错误源自标准偏差。

与对照肽FA相比，P1'-取代的肽对消化更加稳定，而Leu似乎提供了对蛋白水解的最佳保护。这里，氟的引入使肽易于降解。对于Ile来说恰恰相反，因为TfIle导致降解效率降低。α-胰凝乳蛋白酶的S1'亚位点通常容纳具有长侧链的碱性残基[59,62,63]。作为支链氨基酸，由于空间原因，Ile显然不能很好地适应这个位置。用TfIle进一步增加侧链体积会加剧这种效应。然而，在HfLeu的情况下，氟取代基似乎与结合位点的氨基酸残基发生有利的相互作用，因此使P1'-HfLeuFA成为比非氟化Leu肽更好的底物。如我们之前的工作[39,40,64]所述，有几种这样的相互作用是可能的。

α- chymotrypsin的S2'亚位点具有疏水特性，因此更适合疏水残基[59,65]。然而，与孵育120分钟后的FA相比，更疏水的肽P2'-LeuFA，P2'-HfLeuFA，P2'-IleFA，P2'-TfIleFA对α-胰凝乳蛋白酶的消化更稳定。24小时后，只有氟化类似物比对照FA降解更少。全长P2'-HfLeuFA和P2'-TfIleFA分别以高达44％和24％的百分比存在，而在P2'位置用Leu和Ile取代导致与FA相比加速的蛋白水解。因此，HfLeu和TfIle都对该位置的蛋白水解具有保护作用。

ESI-ToF质量分析证实携带Phe的位置P1是α-胰凝乳蛋白酶的主要切割位点（图3）。还观察到P1'-LeuFA和P1'-HfLeuFA中的Leu和HfLeu的C-末端切割（图3，参见支持信息文件1，表S4），这意味着切割位点向C末端移位一个。残留。这可能是α-胰凝乳蛋白酶不仅偏爱芳香族残基而且偏爱S1口袋中的疏水性残基的结果，因此，HfLeu被α-胰凝乳蛋白酶的P1结合口袋所接受。

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图3：用α-胰凝乳蛋白酶消化文库肽中观察到的切割位置。

总之，将氟化Leu和Ile类似物引入α-胰凝乳蛋白酶特异性肽序列可以主要在P2和P2'位置改善蛋白水解稳定性，对P2位置观察到最强的作用。