对胃蛋白酶的蛋白水解稳定性 - 化合物定制合成网

对胃蛋白酶的蛋白水解稳定性（EC 3.4.23.1）

胃蛋白酶是一种天冬氨酸内肽酶，是人类的主要消化酶之一。它在P1和P1'位置[50-54]表现出对疏水性，特别是芳香族残基如Phe，Trp和Tyr的特异性。它具有延伸的活性位点，其可以结合至少7个残基[66,67]，并且肽键断裂发生在P1位残基的N末端。切割效率在很大程度上取决于该氨基酸的特性，Phe和Leu是最有利的残基。在P1'位置优选芳香族氨基酸残基，然而，P1'位置对蛋白水解切割的影响不那么显着[68]。胃蛋白酶通常不会在Val，Ala或Gly键处切割[60]。

胃蛋白酶的S2亚位点优先适应疏水性残基，例如Leu，Ala或正亮氨酸以及β-支链物种Ile和Val，但也可以结合带电荷的残基[69,70]。除了P2-TfIleFA，我们观察到P2修饰的肽比对照肽FA更快地降解，并且这些肽在120分钟后几乎或完全降解（图4））。例如，在24小时后，FA也几乎完全降解，仍然检测到P2-TfIleFA的水平为100％。Leu或Ile的掺入导致完全蛋白水解。值得注意的是，将六个氟原子引入Leu并不会改变这种行为。形成鲜明对比但同样显着的是，将三个氟取代基结合到Ile中导致蛋白水解稳定性增加100％。这些结果表明Leu，HfLeu以及Ile很好地适应胃蛋白酶的S2亚位点。相比之下，TfIle虽然比HfLeu [44]小，但似乎不适合胃蛋白酶的S2口袋。

图4：在30mM的10mM乙酸盐缓冲液（pH4.0）中用胃蛋白酶孵育120分钟（左）和24小时（右）后剩余的底物的百分比。显示的数据代表三次独立测量的平均值。错误源自标准偏差。

为了比较P1'取代的肽，只有P1'-HfLeuFA在120分钟后显示与对照肽FA相同的持久性，而所有其他序列被更快地消化。在这里，将氟引入Leu似乎使肽稳定了约20％。有趣的是，在24小时后，这种趋势被逆转，并且与烃类似物相比，P1'-HfLeuFA肽被去稳定至17％的量，但是两种肽比对照FA稍微更稳定。将TfIle纳入该位置并未显示出显着影响。虽然氟取代基减慢了消化过程（参见支持信息文件1），图S2b），含有TfIle的肽及其烃类似物在24小时后被完全消化。S1'亚位点具有疏水特性，因此更喜欢容纳疏水或芳香残基[71]。Ile和TfIle显然很好地适应了这个位置，而Leu和HfLeu则没有。

胃蛋白酶的S2'亚位点有利于疏水性氨基酸，但也接受带电荷的极性氨基酸如Glu和Thr [52,72]。120分钟后，肽P2'-LeuFA，P2'-IleFA和P2'-TfIleFA比对照FA更快地降解。相反，P2'-HfLeuFA仅被消化至5％。这种效果在24小时后更加明显。虽然所有其他P1'取代的肽以及对照肽FA几乎或完全被消化，但P2'-HfLeuFA仍然存在至约76％。在这种情况下，氟化导致胃蛋白酶的蛋白水解保护。Hfleu显然没有很好地适应这个位置。正如已经观察到的位置P1'，向Ile中引入三个氟原子减慢了蛋白质水解，尽管两种肽在24小时后完全消化。

对于我们文库的几乎所有肽，我们在P1位置观察到Phe的预期解理模式（图5，参见支持信息文件1，表S5）。只有P2'-HfLeuFA在设计的切割位点没有水解，而是仅在HfLeu残基的N末端发生切割，因此证明HfLeu占据P1'位置。在P2'-TfIle的情况下，我们发现了另外两个被胃蛋白酶切割的肽键，即N末端切割成TfIle和Phe。这些发现表明S1'亚位点比胃蛋白酶的S2'位点更容易适应庞大的疏水残基。对于P1'-LeuFA和P1'-HfLeuFA我们发现一个附加的切割位点处的肽键亮氨酸P1' -Ala P2'和HfLeu P1' -Ala P2'被水解，分别的，这意味着所述切割位点是由一个残基向C末端移位。之前也检测到α-胰凝乳蛋白酶的这种裂解模式，并且表明HfLeu在其S1结合位点被胃蛋白酶很好地接受。此外，我们鉴定了P2-HfLeuFA的第二个切割位点，其中Phe的N-末端的肽键也被蛋白水解切割。这意味着切割位点移位使得HfLeu占据P1和Phe P1'位置。然而，这完全符合胃蛋白酶的特异性，胃蛋白酶优选在易断裂键的上游和下游都具有庞大的疏水性和芳香族氨基酸。