分享一篇发表在Nature Communications上的文章Cross-link assisted spatial proteomics to map sub-organelle proteomes and membrane protein topologies。文章的通讯作者是来自德国莱布尼茨分子药理学研究所（FMP）的刘凡教授，她们组致力于开发交联质谱分析方法来解析复杂生物系统中的蛋白质相互作用图谱。
细胞中存在多种发挥特定功能的细胞器和亚细胞器区域，而空间蛋白质组学能够快速全面的对这些区域的特征进行描述。目前已有通过细胞器分离或者临近标记的空间蛋白质组学技术，但是其可控性及亚细胞器定位的准确性仍有提升空间。在本文中，作者基于交联质谱技术建立了交联辅助的空间蛋白质组学（CLASP）技术，来帮助更加精确地绘制亚细胞器区域的空间蛋白质组。在全蛋白质组的交联质谱中能够鉴定到已知亚细胞器定位的一些定位标志物蛋白，而CLASP技术预期能够在识别这些LMs的基础上帮助确定与LMs直接交联的蛋白的亚细胞器定位，并提供包括膜蛋白拓扑结构在内的更多细节信息。在实验流程上，作者使用二琥珀酰亚胺基亚砜DSSO作为交联剂，DSSO的交联长度在0.5-2nm区间，比邻近标记技术的标记半径更小，预期可以更精确提供蛋白的定位信息。使用DSSO对从293T细胞中提取的线粒体进行交联，之后进行酶解、SCX分离以及LC-MS分析，在CID-MS2-MS3模式中，对MS2中具有特定交联肽质量差的峰进行MS3扫描；最终的结果搜索后和已有的线粒体蛋白质组数据库进行对比，并绘制蛋白相互作用网络。在数据分析中，作者首先从DSSO交联的样品中鉴定到了1451个蛋白的13971个独特交联，并在结构已知的蛋白上确认了交联模式符合DSSO的特点，这确保了初始数据的可靠性。去掉蛋白网络中无交联蛋白或者脱节的蛋白簇后，作者得到了更可信的748个蛋白产生的2523个交联。将数据中蛋白相互作用链接数足够多且有确切亚细胞器定位的31个蛋白与有其他充足数据支持的213个高特征蛋白合并作为LMs，这些LMs延伸出的蛋白网络能够覆盖整个交联网络的72%，并涵盖不同的亚细胞器定位，能够帮助确定蛋白的真实细胞定位。在CLASP注释的LMs直接交联的蛋白中，约一半蛋白有着与以前报道一致的定位注释；此外，CLASP也提供了3个新的线粒体相关蛋白信息、修改了95个已知线粒体蛋白的亚细胞器定位、更正24种膜蛋白的拓扑结构。和之前报道过的BioID的数据相比，CLASP注释到的蛋白质更少，但是亚细胞器定位效果显著提高，具有更好的空间特异性。作者还使用了可富集-切割的DSBSO交联剂进行实验，发现进一步提高了CLASP的注释数目，并有相似的精确性。作者后续又通过共聚焦成像、碱性碳酸盐提取、蛋白酶保护实验等方式验证了CLASP提供的新的线粒体蛋白及相关蛋白的定位以及拓扑结构信息，证明了其结果的可靠性；作者也将这一套方法应用在了小鼠脑部突触囊泡空间蛋白质组的分析中。最后，文章还提供了自动化CLASP的Python工具，仅需要XL-MS数据和Swiss-Prot的蛋白注释作为输入，可供研究者使用。文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-47569-x原文引用：https://doi.org/10.1038/s41467-024-47569-x
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