红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L. 的干燥花，具有活血通经、散瘀止痛的作用^[1]，是临床上常用的活血化瘀药^[2]。红花中含有黄酮类、

甾体类、酚酸类、双醇类、木脂素类、查耳酮类、炔类以及挥发油等化学成分。其中黄酮类化合物主要成分为羟基红花黄色素A（HSYA）^[3-5]。现代研究表明^[6-9]，红花具有良好的抗心血管疾病、调血脂、调节代谢等多种药理作用，在中成药中多以其水提取物为用，但由于其脂溶性较差，导致其生物利用度较低^[10]。因此，有必要通过制剂学手段改善红花提取物的脂溶性，提升和拓展其临床价值。

磷脂复合技术作为一种新的改善药物脂溶性的有效途径，在改善药物的溶解性、提升吸收性能方面取得了显著成效^[11-13]。将红花提取物制备成磷脂复合物可通过增强HSYA脂溶性促进透膜吸收，进一步提高其生物利用度^[14]。本研究在前期基础上，采用单因素实验结合Box-Behnken法优化红花提取物磷脂复合物的制备工艺，并对其体外透膜性能进行考察。

1  仪器与试药

1.1  仪器

Thermo ScientificDionex UlMate 3000高效液相色谱仪，配有四元泵、DAD检测器，美国Thermo-Fisher公司；色谱柱为BD HypersilC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AR1140电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海欣齐科学仪器有限公司；KH-400KDE型高功率数控超声清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HJ-4多头磁力加热搅拌器，常州国华电器有限公司；TP-6智能透皮扩散仪，天津市精拓仪器科技有限公司；WD-A型药物稳定性检查仪，天津药典标准仪器厂。

1.2  试药

HSYA对照品（批号MUST-18082905，质量分数99.88%），成都曼斯特生物科技有限公司；红花提取物（批号2018-10-1）实验室自制；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水；生理盐水；大豆卵磷脂，批号180701，磷脂酰胆碱（PC）≥50%，江苏曼氏生物科技股份有限公司。

牛蛙，体质量（500±10）g，批号NW-20190316，由成都达硕生物有限公司提供。

2  方法与结果

2.1  磷脂复合物的制备及复合率的测定

2.1.1  红花提取物的制备^[15]  取红花药材适量，加8倍量水于90 ℃温浸提取2次，每次60 min，滤过，合并提取液。滤液减压浓缩至相对密度为1.06～1.10（60 ℃）的清膏，喷雾干燥，进口温度125～135 ℃，出口温度60～70 ℃，即得红花提取物，HSYA质量分数为2.27%。

2.1.2  磷脂复合物的制备及复合率测定  取红花提取物与大豆卵磷脂置于圆底烧瓶内，加入复合溶剂，置于恒温磁力搅拌器上，在规定温度下复合一定时间，减压回收复合溶剂，收集沉淀物，减压干燥，即得红花提取物磷脂复合物。

利用红花提取物难溶于三氯甲烷，而大豆卵磷脂和磷脂复合物易溶于三氯甲烷的特性，精密称定1 g红花提取物磷脂复合物，加入20 mL三氯甲烷，每隔5 min振荡1次，持续30 min，使其充分溶解，溶液滤过，收集沉淀，称定质量。

复合率＝(A₁－A₂)/A₁

A₁为初始投药的红花提取物磷脂复合物质量，A₂为未反应的药物沉淀质量

2.2  单因素考察

2.2.1  反应溶剂的考察  设定红花提取物与大豆卵磷脂的投料比为0.5，反应温度55 ℃，反应时间为1.5 h，红花提取物的质量浓度为2.5 mg/mL，分别考察四氢呋喃、无水乙醇、甲醇、醋酸乙酯4种反应溶剂对复合率的影响。结果分别为（77.84±1.35）%、（76.74±2.91）%、（91.75±1.81）%、   （49.37±1.73）%。结果提示，以甲醇为反应溶剂的复合率最高，因此，选择甲醇为反应溶剂。

2.2.2  不同药脂比的考察  以甲醇为反应溶剂，反应温度为50 ℃，反应时间为1.5 h，反应系统中红花提取物的质量浓度为2.5 mg/mL，分别考察红花提取物与大豆卵磷脂投料比为2.0、1.0、0.5时的磷脂复合物复合率。计算得复合率分别为（80.73±1.98）%、（85.60±0.94）%、（91.82±1.81）%。结果提示，磷脂所占比例越大，复合率越高。

2.2.3  药物质量浓度的考察  以甲醇为反应溶剂，药物投料比例为0.5，反应温度为50 ℃，反应时间为1.5 h，分别考察反应系统中红花提取物质量浓度为2.5、5.0、8.0 mg/mL时的磷脂复合物复合率情况。计算得复合率分别为（92.50±1.31）%、（84.53±1.40）%、（79.12±1.76）%。结果提示，药物质量浓度对复合率影响较大，药物质量浓度越小，复合率越高。

2.2.4  反应温度的考察  以甲醇为反应溶剂，药物投料比为0.5，反应系统中药物质量浓度为2.5mg/mL，反应时间为1.5 h，分别考察反应温度为40、50、60 ℃时药物磷脂复合物复合率情况。计算得复合率分别为（90.64±1.31）%、（92.70±1.26）%、（93.23±1.03）%。结果提示，当反应温度高于50 ℃时，复合率趋于稳定。

2.2.5  反应时间的考察  以甲醇为反应溶剂，药物投料比为0.5，反应系统中药物质量浓度为2.5mg/mL，反应温度为50 ℃，分别考察反应时间为1.5、2.0、2.5 h时磷脂复合物复合率情况。计算得复合率分别为（91.11±0.99）%、（91.80±0.45）%、（92.07±0.85）%。结果提示，复合时间超过1.5 h时对复合率的影响较小。

2.3  Box-Behnken法优化红花提取物磷脂复合物制备工艺

通过单因素实验结果，筛选出不同药脂比（A）、反应温度（B）、药物质量浓度（C）3个因素作为考察对象，采用Design Expert 8.0.6.1统计分析软件的Box-Behnken响应面法^[16]设计3因素3水平，以复合率（Y）为指标优选最优工艺并验证，因素与水平安排见表1，试验安排与结果见表1。

以Y为响应值进行模型拟合，得出拟合方程   Y＝113.27－21.44 A－0.522 B－6.33 C＋0.02 AB＋0.84 AC＋0.01 BC＋10.27 A²＋0.006 B²＋0.12 C²，（r²＝0.977 8，P＜0.0001，失拟度P＝0.089 0＞0.05），说明该模型预测值与实测值之间具有较高的相关性，且模型失拟度没有显著性差异，说明该方程能够反映实际情况。

根据方差分析结果（表2）可知，模型的1次性项A和C对结果均有显著性影响（P＜0.000 1），方程的交互项AC、AB、BC均对结果无显著影响，A、B、C 3个因素之间无交互作用。

根据2次多项式模型方程拟合结果，绘制效应曲面图，见图1。效应面的等高线图和三维效应曲面图可以直观地反映因素间交互作用。由图1可见，A、C因素等高线呈椭圆形且较密集，且其响应面3D图弯曲程度稍大，说明其交互作用较强，A、C因素为影响红花提取物磷脂复合物复合率的主要交互因素。由效应图结果可得，当A因素在1.5～2.0，B因素在55～60 ℃，C因素在2.5～5 mg/mL时，复合率指标效果最好。Design Expert软件优选的最佳工艺处方为红花提取物与大豆卵磷脂的比例为1.5、反应系统中药物质量浓度为5mg/mL、反应温度为55 ℃、反应时间为1.5 h为最优制备工艺。

验证实验：最终确定对优选出来的最佳工艺条件进行验证试验，重复3次，计算复合率。最终复合率为（90.55±1.72）%，表明该模型具有良好的预测性，且工艺稳定可行。

2.4  红花提取物磷脂复合物的表征

2.4.1 紫外吸收光谱研究  取适量的HSYA、红花提取物、红花提取物磷脂复合物（质量比1∶1）、红花提取物与磷脂的物理混合物（质量比1∶1）、大豆卵磷脂，分别溶于25%甲醇，以25%的甲醇为空白，在200～800 nm进行扫描。结果如图2所示。结果表明，大豆卵磷脂在285 nm波长处有吸收峰，HSYA在400 nm处有较大吸收，其余波长均无吸收。磷脂复合物及红花提取物与物理混合物的吸收光谱形状相同，分析表明红花提取物形成磷脂复合物后发色团结构没有发生变化，说明没有新的化合物形成。

2.4.2 红外吸收光谱研究  采用KBr压片法，分别将红花提取物、红花提取物磷脂复合物、红花提取物大豆卵磷脂物理混合物及大豆卵磷脂和KBr以1∶100研磨均匀，压片后在波长为4 000～400 cm⁻¹进行傅里叶红外光谱（FT-IR）测定。结果见图3。

FT-IR光谱如图3所示，红花提取物的特征吸收峰为3 415 cm⁻¹(-OH)，1 659 cm⁻¹ (C = O)，1 169 cm⁻¹ (C-O)。大豆卵磷脂的特征吸收峰为，3 420 cm⁻¹ (-OH)，2 924 cm⁻¹和2 855 cm⁻¹⁽C-H)，在1 738 cm⁻¹⁽C＝O)，1 241 cm⁻¹ (P＝O)，1 124 cm⁻¹ (P-O- C)，969 cm⁻¹ [N+(CH₃)₃]。结果显示，红花提取物和大豆卵磷脂的物理混合物FT-IR上特征吸收峰基本是两者主要峰的叠加，说明物理混合物中二者之间并未发生相互作用。

而红花提取物磷脂复合物的FT-IR谱图与之不同，在3 415 cm⁻¹处及1 659 cm⁻¹，峰的大小及峰形都发生了一定的变化，这说明在进行磷脂复合的过程中红花提取物结构中的官能团与大豆卵磷脂分子中的官能团之间发生了相互作用，表明磷脂复合物是由分子间相互作用形成的。

2.5  红花提取物磷脂复合物透膜性考察

2.5.1  含量测定及方法学验证

（1）色谱条件：色谱柱为BD Hypersil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液（26∶2∶72）；检测波长为403 nm；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；理论板数按HSYA峰计算均不低于3 000。色谱图见图4。

（2）对照品溶液的制备：精密称取HSYA对照品适量，制成质量浓度分别为0.025 6、0.102 4、 0.409 6、1.638 4、6.552 6、13.107 2 μg/mL的溶液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得HSYA对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：精密吸取红花提取物磷脂复合物在24 h时透膜接收液1 mL，于3 000 r/min 离心5 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

（4）方法学验证：分别精密吸取上述HSYA对照品溶液10 μL，测定峰面积，以峰面积和质量浓度进行线性回归，得回归方程Y＝39.266 X＋0.813 5，r²＝0.999 4，结果表明，HSYA质量浓度在0.025 6～13.107 2 μg/mL与峰面积线性关系良好。

分别精密吸取13.107 2 mg/mL的HSYA对照品溶液10 μL，按上述液相条件重复进样6次，结果峰面积的RSD为1.51%，表明精密度良好。

精密吸取红花提取物磷脂复合物在24 h时透膜接收液，平行制备6份供试品溶液，分别进样10 μL，按上述色谱条件分别测定峰面积，得RSD为1.85%，表明该方法重复性良好。

分别于0、2、4、8、10 h取得供试品溶液，进样10 μL，按上述色谱条件分别测定峰面积，得RSD为1.64%，表明该供试品溶液在10 h内稳定。

取样品溶液0.5 mL 9份，分成3组，分别按已知质量分数的50%、100%、150%等3个水平加入HSYA对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL，测定含量，计算加样回收率为（99.61±3.58）%，回收率的RSD为3.59%，表明该方法的准确度良好。

2.5.2  体外透膜实验  用牛蛙腹部皮肤为透膜材料，采用立式改良Franz扩散池为评价方法，以HSYA的透膜量为评价指标，对红花提取物磷脂复合物的透膜性进行评价^[17]。

（1）离体皮肤的制备：参考文献方法^[18]，利用蛙皮与黏膜结构的相似性，故以离体牛蛙腹部皮肤为模型研究^[19]。牛蛙双毁髓处死（用细针垂直插入牛蛙的枕骨大孔（位于牛蛙的颈部，用手可以摸到凹陷处））。分离牛蛙腹部皮肤，用生理盐水反复冲洗，至无混浊为止。用超纯水将蛙皮冲洗干净，滤纸吸干表面的水分，−20 ℃冷藏，备用。

（2）药物溶液的制备：分别称取红花提取物1 g，药脂比2的红花提取物磷脂复合物1.5 g，药脂比1的红花提取物磷脂复合物2 g，药脂比0.5的红花提取物磷脂复合物3 g，置于锥形瓶中，加入10 mL生理盐水，使药物充分溶解，3000 r/min离心10 min，取上清液，作为供试品溶液。

（3）透皮扩散实验：取离体皮肤，真皮层面向接收池（内），角质层面向供给池（外）固定在立式改良Franz扩散池上，除去蛙皮多余部分。在接收室内加入磁力转子和氯化钠溶液15 mL（接收池的容积为15 mL），将黏膜固定在接收室与供给室之间，将扩散池置于恒温磁力搅拌器上，将转速调为3 000 r/min，水浴温度为37 ℃，平衡20 min。分别将供试液加入到各装置的供给室内，分别于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、24.0 h，用移液管从接收池吸取1 mL溶液，同时补充1 mL生理盐水，使接收池中液体体积保持恒定。将所取样液于3 000 r/min离心5 min，取上清液作为样品溶液。以HSYA的含量为评价指标，计算累积渗透量（Q_n）和稳态透膜速率（J_ss）^[20]。将Q_n对渗透时间t进行回归，所得直线斜率即为J_ss。

Q_n＝(VC_n＋V_iC_i)/A

C_n为第n个取样点质量浓度，C_i为第i个取样点质量浓度，A为渗透面积（扩散池直径1.3 cm，A＝5.31 cm²），V为接收室中接收液的体积，V_i为第i个时间段接收室中取出接收液的体积

由透膜实验考察结果可知，磷脂复合物显著改善了红花提取物的透膜性能。红花提取物药脂比分别为2、1、0.5的磷脂复合物24 h累积渗透量（Q₂₄）分别为（15.07±1.24）、（15.61±0.92）、（21.94± 1.54）、（21.05±1.39）μg/cm²。

由图5可知，透膜给药初始阶段，红花提取物磷脂复合物（2、1、0.5）的J_ss较红花提取物无明显差异。随着给药时间的增加，红花提取物磷脂复合物的Q_n与J_ss逐渐增加。当药脂比为1时其Q_n与J_ss最佳，优于药脂比为2与0.5的红花提取物磷脂复合物，说明药物的透膜溶出速率并不完全随着磷脂的用量而增加。据数据分析，1∶0.5的红花提取物磷脂复合物因为磷脂的量不足，并未完全包合药物，而1∶1与1∶2的红花提取物磷脂复合物已经将药物包合完，故结果无明显差异，同时，考虑到磷脂复合物中磷脂用量越大会使药物剂量也随之增加，稳定性也会受到影响，不便于药物生产贮存，因此，为了提高红花提取物的载药量，最终确定药脂比为1∶1。

由实验结果（表3）可知，药物Q_n对时间呈良好的线性关系，r²均在0.99以上，符合一级动力学方程。当药物与磷脂的比例为1∶1时，红花提取物磷脂复合物的J_ss较红花提取物的J_ss有明显的提高，继续提高磷脂用量对其透膜性能改善不明显，因此，选择药物与磷脂的比例为1∶1作为红花提取物磷脂复合物制备工艺的药脂比。

3  讨论

课题组前期考察了红花提取物的制备工艺，溶解度实验结果提示，红花提取物水溶性好，脂溶性较差，因此，将其制成磷脂复合物改善其油水分配系数。在磷脂复合物制备工艺研究中考察了反应溶剂、药脂比、反应时间、反应温度及药物浓度等因素对复合率的影响，结果提示，以甲醇作为复合溶剂复合率较高。反应时间和反应温度对复合率并无显著性影响，选择反应时间为1.5 h，反应温度为55 ℃。在单因素筛选的基础上对影响较大的药脂比与药物浓度等因素，采用Box-Behnken效应面法进行优化，优选的制备工艺为红花提取物与大豆卵磷脂的比例为0.5、反应系统中药物质量浓度为5 mg/mL、反应温度为55 ℃、反应时间为1.5 h。结果表明，该回归模型能较好地预测磷脂复合物的符合率，偏差较小。

本研究采用响应曲面法对制备红花提取物磷脂复合物工艺参数进行优化，并通过透膜实验改善并确定了最终工艺。红花提取物磷脂复合物透膜性能得到明显改善，有利于拓展和提升红花提取物临床效用。

参考文献（略） 

来  源：王  瑜，史亚军，邹俊波，张小飞，邰  佳，梁玉琳，周  晓，杨艳君，王瑞杰. 红花提取物磷脂复合物的制备及其透膜性研究 [J]. 中草药, 2019, 50(17):4084-4090.